響應(yīng)面法優(yōu)化繡球菌副產(chǎn)物多糖提取工藝的研究

黃子建

摘?要：為開發(fā)利用繡球菌副產(chǎn)物，提高繡球附加值，考察提取溫度、提取時間、料水比3個因素對繡球菌副產(chǎn)物多糖得率的影響，在此基礎(chǔ)上建立響應(yīng)面分析模型，經(jīng)線性回歸擬合，回歸模型：多糖得率（%）=7.19+0.26A-0.35B-0.84C-0.088AB-0.57AC+0.54BC-0.35A2-3.38B2-0.42C2，P<0.0001，達(dá)極顯著水平;失擬項P=0.5101，不顯著，說明該模型成立。利用DesignExpert8.0軟件對模型進(jìn)行優(yōu)化，以多糖得率最高為優(yōu)化目標(biāo)，得出繡球菌副產(chǎn)物多糖提取的最優(yōu)工藝條件為：提取時間3.83 h，提取溫度為78.75℃，料液比為1∶30，多糖得率達(dá)到7.89%。根據(jù)實際情況將工藝參數(shù)修正為：提取時間3.83 h，提取溫度為79.00℃，料液比為1∶30。采用上述最優(yōu)工藝條件進(jìn)行繡球菌副產(chǎn)物多糖提取，測得實際多糖得率為8.01%。

關(guān)鍵詞：繡球菌副產(chǎn)物;多糖;提取;響應(yīng)面法

中圖分類號：S 646?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號：0253-2301（2019）10-004

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.10.004

Abstract： In order to develop and utilize the byproducts of Sparassis crispa and increase the added value of hydrangea， the effects of extraction temperature， extraction time and ratio of feed to water on the polysaccharide yield of byproducts of Sparassis crispa were investigated. On this basis， the model of response surface analysiswas established， and by linear regression fitting， the regression model was obtained： polysaccharide yield （%） = 7.19+0.26A-0.35B-0.84C-0.088AB-0.57AC+0.54BC-0.35A2-3.38B2-0.42C2， P<0.0001， reaching a very significant level. The lack of fit （P=0.5101） was not significant， indicating that the model was valid. Then， the model was optimized by using Design-Expert8.0 software， with the highest polysaccharide yield as the optimization target， and the optimal technological conditions for extracting polysaccharides from the byproducts of Sparassis crispa were as follows： extraction time was 3.83 h， extraction temperature was 78.75℃， and the solid-liquid ratio 1∶30， thus the polysaccharide yield could be up to 7.89%. According to the actual situation， the technological parameters were revised as follows： extraction time was 3.83 h， extraction temperature was 79.00℃， and the solid-liquid ratio was 1∶30. The polysaccharides were extracted from the byproducts of Sparassis crispa under the optimal conditions， and the actual polysaccharide yield was 8.01%.

Key words： Byproducts of Sparassis crispa; Polysaccharide; Extraction; Response surface method

繡球菌Sparasis crispa Wulf.Fr.屬擔(dān)子菌亞門、異隔擔(dān)子菌綱、無 （非）褶菌目、繡球菌科、繡球菌屬。繡球菌子實體潔白細(xì)嫩，鮮美可口，是一種極其珍貴的食藥用真菌，20世紀(jì)90年代在日本首次獲得栽培成功，并進(jìn)行商業(yè)性生產(chǎn)[1]。繡球菌營養(yǎng)十分豐富，并且具有抗腫瘤[2-4]、抗氧化[5-6]、免疫調(diào)節(jié)[7-8]等多種生物活性。其主要的活性物質(zhì)為繡球菌多糖，尤以繡球菌β-葡聚糖（簡稱SCG）含量最高[9]。據(jù)日本東京食品研究實驗室的檢測結(jié)果，可高達(dá)干重的43.6%[10]。Kim等[11]試驗測得繡球菌水提物中β-葡聚糖含量為39.3%;廉添添等[12]測定繡球菌柄部和瓣片部分中β-葡聚糖含量均達(dá)40%以上。肖楠等[13]對10種食用菌副產(chǎn)物中的主要營養(yǎng)成分進(jìn)行分析測定，發(fā)現(xiàn)食用菌副產(chǎn)物中含有豐富的蛋白質(zhì)和多糖等營養(yǎng)成分，具有較大的再利用價值。張樂等[14]比較了金針菇上部子實體和菌柄基部中的營養(yǎng)成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個部位的主要營養(yǎng)成分種類相似，蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低，富含多糖、礦物質(zhì)和氨基酸，有很高的營養(yǎng)價值和較好的開發(fā)前景。對繡球菌多糖的提取已有較多報道，但多是以可食用部分為研究對象[15-17]，而關(guān)于其副產(chǎn)物中多糖的研究極少。繡球菌副產(chǎn)物是繡球菌加工過程產(chǎn)生的菇腳、邊料等，約占繡球菌子實體總重的15%～30%。因此，開發(fā)以繡球菌副產(chǎn)物為原料進(jìn)行多糖提取，不僅充分利用資源，又可節(jié)約環(huán)保，提高繡球菌的附加值。

本研究通過單因素試驗考察提取時間、提取溫度、料液比對繡球菌副產(chǎn)物多糖得率的影響，進(jìn)而采用響應(yīng)面試驗方法，優(yōu)化確定繡球菌副產(chǎn)物活性多糖最優(yōu)提取參數(shù)，以期最大限度地從繡球菌副產(chǎn)物中提取多糖，為綜合利用繡球菌副產(chǎn)物提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

繡球菌下腳料由福建容益菌業(yè)科技研發(fā)有限公司提供。無水乙醇、苯酚、氯仿、正丁醇、硫酸、三氯化鐵、水楊酸均為分析純，購自中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司。

1.2?儀器與設(shè)備

DL SPW10TJ型5型低速大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;UV2800AH型紫外可見分光光度計[尤尼柯（上海）儀器有限公司];R209型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）;低溫超速離心機(jī)（SIGMA公司）;冷凍干燥機(jī)（CHRIST公司）。

1.3?試驗方法

1.3.1?繡球菌下腳料收集?收集繡球菌加工后的菇腳、菇裙角等下腳料，50℃烘干備用。

1.3.2?單因素試驗?采用單因素試驗法考察提取溫度、料液比和提取時間對多糖得率的影響。以基礎(chǔ)條件為料液比1∶30、提取溫度70℃、提取時間3 h的條件下，設(shè)計各因素水平為：料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50;提取溫度為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃;提取時間為1、2、3、4、5 h。

1.3.3?響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計?根據(jù)單因素試驗提取溫度、料液比和提取時間對多糖得率影響的分析結(jié)果，采用響應(yīng)面法在三因素三水平對提取時間、提取溫度、料液比進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理進(jìn)行設(shè)計試驗要求，具體見表1。

1.3.4?多糖得率的測定?配置葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照苯酚硫酸法測定繡球菌副產(chǎn)物多糖，計算多糖提取率。多糖得率（%）=（提取液中多糖含量×提取液體積/所用樣品總量）×100

1.3.5?統(tǒng)計分析?每個試驗須進(jìn)行3次，對應(yīng)的響應(yīng)值取3次試驗結(jié)果的平均值。利用軟件DesignExpert8.0進(jìn)行試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?單因素試驗結(jié)果

2.1.1?提取溫度對繡球菌副產(chǎn)物多糖提取率的影響?由圖1可見，提取溫度50～80℃，多糖得率隨溫度升高而增加，90℃時略有下降。因此選擇提取溫度70℃、80℃、90℃進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.2?提取時間對繡球菌副產(chǎn)物多糖提取率的影響?由圖2所示，多糖得率隨提取時間的延長而提高，但提取時間超過3 h后多糖得率略有下降。綜合考慮選擇提取時間2、3、4 h進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.3?料液比對繡球菌副產(chǎn)物多糖提取率的影響?由圖3可以見，料液比1∶10、1∶20，多糖得率隨加水量的增加而增加，但料液比在1∶20后，提取液的增加對多糖得率的影響較小。綜合考慮選擇料液比1∶10、1∶20、1∶30進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2?響應(yīng)面的分析及提取工藝的條件優(yōu)化

為進(jìn)一步優(yōu)化繡球菌副產(chǎn)物多糖提取的工藝，在上述單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取提取溫度、提取時間和料液比3個因素作為參數(shù)，多糖得率作為指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面Box-Behnken 試驗設(shè)計分析，具體如表2所示。

利用軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸擬合，得到的分析結(jié)果見表3和表4。經(jīng)擬合后，多糖得率（%）=7.19+0.26A-0.35B-0.84C-0.088AB-0.57AC+0.54BC-0.35A2-3.38B2-0.42C2。回歸模型 P<0.0001，表明回歸模型達(dá)極顯著水平;失擬項 P=0.5101，不顯著，說明該模型成立?；貧w模型中一次項C達(dá)顯著水平，二次項B2達(dá)極顯著水平。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9132，說明響應(yīng)值的變化有91.32%來源于所選變量，得到模型擬合程度好，試驗誤差小。

2.3?因素間的交互作用分析

如圖4所示，提取時間對繡球菌副產(chǎn)物多糖得率影響較小。而提取溫度對繡球菌副產(chǎn)物多糖得率影響較大，提取溫度70～80℃時，隨溫度升高得率增加，但提取溫度超過80℃后，多糖得率反而下降。

如圖5所示，當(dāng)提取溫度不變時，料液比對繡球菌副產(chǎn)物多糖得率的影響明顯，隨著加水量的增加有先增后平緩的趨勢;在不同料液比條件下，提取溫度對繡球菌副產(chǎn)物多糖得率影響均呈現(xiàn)先增加后減少的而趨勢。

如圖6所示，在長時間提取條件下，料液比對繡球菌副產(chǎn)物多糖得率的影響明顯，隨著加水量的增加而增加;但在較短提取時間條件下，隨加水量的增加繡球菌副產(chǎn)物多糖得率變化不明顯。

2.4?試驗結(jié)果驗證

利用Design-Expert8.0軟件對模型進(jìn)行優(yōu)化，以多糖得率最高為優(yōu)化目標(biāo)，得到最優(yōu)提取工藝：提取時間3.83 h，提取溫度為78.75℃，料液比為1∶30，多糖得率達(dá)到，此條件下模型預(yù)測多糖得率為7.89%。根據(jù)實際情況修正為：提取時間3.83 h，提取溫度為79.00℃，料液比為1∶30。以此條件進(jìn)行結(jié)果驗證對比試驗，重復(fù)3次，結(jié)果見表4。

由表4可知，當(dāng)提取時間3.83 h，提取溫度為79.00℃，料液比為1∶30，多糖得率8.01%，誤差率均小于3%，真實值與預(yù)測值相近，與預(yù)測值較為接近，說明回歸方程能夠比較真實地反映各因子對多糖得率的影響， 能較好地模擬和預(yù)測這兩個指標(biāo)。

3?結(jié)論

選取提取溫度、提取時間和料液比3個因素作為參數(shù)，繡球菌副產(chǎn)物多糖得率作為指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得出回歸模型：多糖得率（%）=7.19+ 0.26A-0.35B-0.84C-0.088AB-0.57AC+0.54BC-0.35A2- 3.38B2-0.42C2。根據(jù)實際情況，結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析得到繡球菌副產(chǎn)物多糖提取的最優(yōu)工藝條件為：提取時間230.0 min，提取溫度為79.00℃，料液比為1∶30。經(jīng)驗證試驗得到多糖得率達(dá)到8.01 %，驗證試驗結(jié)果與理論預(yù)測值誤差小于1 %，說明建立的數(shù)學(xué)模型可靠性高，可用于繡球菌副產(chǎn)物綜合利用多糖提取工藝優(yōu)化。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃建成，李開本，林應(yīng)椿，等.繡球菌子實體營養(yǎng)成分分析[J].營養(yǎng)學(xué)報，2007，29（5）：514-515.

[2]OHNO N，MIURA NN，NAKAJIMA M，et al.Antitumor 1，3-β-glucan from cultured fruit body of Sparassis crispa[J].Biol Pharm Bull，2000，23（7）：866-872.

[3]趙慧慧，盧偉東，徐麗麗，等.繡球菌多糖誘導(dǎo)K562、THP-1細(xì)胞凋亡的研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2013，29（21）：149-153.

[4]PCTROVA ROUMYANA D，MAHAJNA JAMAL A，DENCHEV CVETOMIR M.Potential Role of Medicinal Mushrooms in Breast Cancer Treatment： Current Knowledge and Future Perspectives[J].International Journal of Medicinal Mushrooms，2005，7（1&2）：141-146.

[5]禹國龍，葉琳，苑世婷，等.繡球菌多糖的提取與抗氧化活性研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，19（4）：11-14.

[6]崔麗霞，張瑩，鄭義.繡球菌多糖的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化作用[J].食品工業(yè)，2013，（6）：24-28.

[7]王萌皓，郝正祺，常明昌，等.繡球菌多糖表征及其抗氧化和免疫活性[J].菌物學(xué)報，2019，38（5）：707-716.

[8]KIM H S，KIM J Y，RYN H S，et al.Induction of dendritic cell maturation by β-glucan isolated from Sparassis crispa[J].International Immunopharmacology，2010，10（10）：1284-1294.

[9]王宏雨，林勇，林衍銓，等.繡球菌多糖研究進(jìn)展綜述[J].食藥用菌，2016，24（5）：281-284.

[10]KIMURA T.Natural products and biological activity of the pharmacologically active cauliflower mushroom Sparassis crispa[J].BioMed Research International，2013，8（3）：501-508.

[11]KIM H H，LEE S，SINGH T S，et al.Sparassis erispa Suppresses mast cell-mediated allergic inflammation：Role of calcium， mitogen-activated protein kinase and nuclear factor-kB[J].International Journal of Molecular Medicine，2012，30（2）：344-350.

[12]廉添添，楊濤，孫軍德，等.人工栽培繡球菌的鑒定及其子實體β-葡聚糖含量的酶法測定[J].菌物學(xué)報，2014，33（2）：254-261.

[13]肖楠，唐慶九，張勁松，等.食用菌副產(chǎn)物中可再利用的營養(yǎng)成分分析[J].?微生物學(xué)通報，2015，42 （10）：1929-1935.

[14]張樂，王趙改，李鵬，等.金針菇不同部位營養(yǎng)成分分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，44（6）：109-112，124.

[15]楚杰，劉守志，張濤，等.繡球菌多糖提取方法的比較研究[J].中國食物與營養(yǎng)，2016，22（6）：40-42.

[16]洪小君，林端權(quán)，王春蓮，等.應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶提取繡球菌多糖工藝[J].?亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2015，11（1）：40-45.

[17]亢爽，劉娜，張麗霞.繡球菌水溶多糖的提取及其抑菌效果[J].?安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（22）：1-2.

（責(zé)任編輯：林玲娜）