高分辨熔解曲線基因分型技術及其在水稻分子育種中的應用

顧建強

摘?要：高分辨熔解曲線（high-resolution melting， HRM）分型技術是基于不同DNA片段雙鏈熔解溫度差異而進行基因分型的技術，理論上可以區(qū)分單個堿基差異的不同DNA分子。由于其較高的分辨率及無需傳統(tǒng)的凝膠電泳等優(yōu)點，HRM技術發(fā)明后在醫(yī)學診斷、植物分子育種等方面得到了大量應用。通過分析HRM的技術特點，并總結HRM技術在水稻分子育種中的應用進展，最后展望了HRM技術在水稻分子育種中的發(fā)展方向及應用前景。

關鍵詞：高分辨熔解曲線;基因分型;水稻;分子育種

中圖分類號：S 511?文獻標志碼：A?文章編號：0253-2301（2019）10-014

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.10.014

Abstract： High resolution melting was a genotyping technology based on the double-stranded melting temperature differences of different DNA fragments， which could theoretically distinguish different DNA molecules with single base differences. Because of its advantages such as high resolution and the absence of traditional gel electrophoresis， HRM technology has been widely applied in the aspects of medical diagnosis， plant molecular breeding and so on after its invention. By analyzing the technical characteristics of HRM， the application progress of HRM technology in rice molecular breeding was summarized， and then the development direction and application prospect of HRM technology in rice molecular breeding were prospected.

Key words： High resolution melting; Genotyping; Rice; Molecular breeding

高分辨熔解曲線（high-resolution melting， HRM）是一種新型檢測突變和基因分型的技術[1]。由于其檢測的高效性、高分辨率及較低的成本，HRM技術自提出后在醫(yī)學和植物科學等領域都得到了廣泛的應用[2-3]。水稻是我國重要的糧食作物，也是單子葉模式植物，基因編輯和基因聚合育種等分子育種手段在水稻上得到廣泛的應用[4]?；贖RM技術的突變體篩選、全基因組背景標記及功能標記開發(fā)等工作對提高水稻分子育種的效率，降低分析成本發(fā)揮著重要作用，具有廣泛的應用范圍和前景。

1?HRM基本原理

DNA片段為雙螺旋結構，隨著溫度升高DNA雙鏈會逐漸解開，結合實時定量PCR技術，可以通過監(jiān)測熒光信號實時觀察DNA雙鏈的熔解程度，根據(jù)溫度和熔解程度繪制熔解曲線。DNA雙螺旋結構一半解鏈的溫度為熔解溫度（Tm），Tm值和DNA分子的堿基組成及長度相關，GC含量越高，片段越長，Tm值越高。因此可以通過分析DNA熔解曲線測定Tm值對不同的DNA分子進行區(qū)分，實現(xiàn)基因分型。利用熔解曲線實現(xiàn)基因分型的關鍵在于合適的熒光染料及靈敏的檢測設備[5]。熒光染料嵌合在DNA雙鏈中，顯示熒光。在熔解曲線的檢測過程中，隨著溫度逐漸升高，DNA雙鏈逐漸解鏈，熒光染料脫離DNA，成為游離狀態(tài)，使得熒光信號值逐漸降低。在低溫到高溫過程中，儀器每間隔一定的溫度檢測1次熒光信號，最終將采集的熒光信號繪制為熔解曲線。

熒光染料有飽和染料和非飽和染料兩種類型。最早的熒光染料為SYBR Green I，是一種非飽和染料，在DNA雙鏈高溫解鏈時，單鏈部分的染料分子發(fā)生遷移，重新結合到DNA尚未解鏈的雙鏈部分，造成熒光信號強度沒有發(fā)生變化，不能真實反映DNA雙鏈準確的解鏈溫度。而飽和染料則克服了這類問題，DNA解鏈時脫落的染料不會再遷移到未解鏈的部分，熒光信號能真實反映DNA的解鏈程度。飽和染料有LC Green、LC Green Plus（Idaho）、EvaGreens（Biotum）和LightCycler480 ResoLight Dye （Roche）等多種類型。研究發(fā)現(xiàn)，價格較低的EvaGreen使用效果和LC Green效果相當[6]，因此EvaGreen得到了較廣泛的應用[2，7-10]。

由于不同DNA分子間的SNP所導致的Tm值差異細微，因此要求熒光檢測設備控溫準確、精確以及樣品孔間一致性好。2000年，Idaho公司推出了首款高分辨熔解曲線分析儀HR1。該儀器每攝氏度能采集40～120個數(shù)據(jù)點，實現(xiàn)了高精度的熔解曲線分析。但該設備為單通道，無PCR功能，不能滿足高通量檢測的需求[11]。隨后Idaho公司推出了經(jīng)典的LightScanner。LightScanner有96和384兩種通量可以選擇，并且檢測速度快，5 min即可完成，實現(xiàn)了較高通量的檢測。目前市場上多款定量PCR儀如瑞典Roche公司的lightcycle480[12]、QIAGEN公司的Rotor-gene Q[13]和ABI 7500[14]等均有HRM功能。

2?HRM技術和其他分子標記檢測技術比較

2.1?高分辨率和高效率

和傳統(tǒng)電泳方式相比，HRM無需制膠、點樣、電泳、讀帶等繁瑣過程，分析效率高，并且傳統(tǒng)電泳包括分辨率較高的聚丙烯酰胺凝膠電泳也難以區(qū)分2個堿基以下的DNA片段，而HRM可以區(qū)分包括SSR、InDel和SNP在內的各種多態(tài)性[15]。

2.2?高穩(wěn)定性和準確性

和KASP等基于等位基因競爭性擴增方法相比較，擴增過程基本沒有假陽性，其檢測的準確性的關鍵取決于擴增產(chǎn)物的特異性、檢測設備溫度控制的精確度和均一性。隨著設備性能的提升，HRM檢測的穩(wěn)定性和準確性會更有優(yōu)勢。

2.3?適用范圍廣

HRM檢測時只需要待測位點兩側的序列即可，待測位點可以是未知的，而等位基因競爭性擴增則必須已知待測位點信息，并且只能檢測雙等位變異。因此HRM技術有著更廣泛的用途，如復等位基因檢測[8]，突變位點檢測[16-17]等。

3?HRM在水稻分子育種中的應用

基于HRM技術的諸多優(yōu)點，自該方法提出后在水稻分子育種方面也得到了廣泛的應用，包括全基因組背景分子標記開發(fā)、功能分子標記開發(fā)、誘變突變體鑒定、基因編輯后代鑒定等多個領域都得到了廣泛的應用。

3.1?全基因組分子標記開發(fā)

金名捺等[10]2018年根據(jù)9 k的全基因組芯片對2個水稻品種掃描后獲得4198個SNP位點，將其中第12號染色體的部分SNP成功轉化為HRM標記并在群體中進行了驗證。趙均良等[15]利用HRM技術對SSR、InDel和SNP等不同類型的多態(tài)進行了檢測，成功分析了1個G和A轉換的SNP位點，以及1個聚丙烯酰胺凝膠難以區(qū)分的SSR位點和1個InDel位點。上述結果顯示了HRM技術在DNA多態(tài)檢測上的靈敏性及靈活性。靈敏性指能分析SNP，靈活性是指能分析包括SNP、SSR及InDel等多種類型的多態(tài)性。

3.2?功能分子標記開發(fā)及應用

盛夏冰等[12]針對水稻落粒性基因qSH1調控區(qū)的關鍵SNP堿基G到T的突變，通過優(yōu)化擴增片段長度、DNA及鎂離子濃度等，成功地利用HRM技術實現(xiàn)了基因分型，為水稻落粒性的分子育種奠定了基礎。該研究通過比較不同擴增大小的產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，小片段（68 bp）更有利于基因分型。羅文龍等[7]采用了巢式擴增水稻直鏈淀粉含量Wx基因和香味基因fgr功能位點特異性片段，利用HRM技術成功對88份水稻的Wx基因SNP位點及fgr位點的InDel進行了分型，顯示了在HRM技術平臺的通用性，可以同時對SNP和InDel等不同類型的多態(tài)性開展分析。司浩杰等[16]將水稻DNA簡易提取方法和HRM技術相結合，對花培后代水稻光敏不育基因PGMS進行了高效檢測。平均96個樣品取樣、DNA提取和檢測時間控制在2.5 h。

水稻稻瘟病抗性基因由于存在多個復等位基因及在基因組中存在同源序列，導致抗性功能標記檢測繁瑣，金名捺等[8]利用HRM成功地利用HRM技術開發(fā)了針對Pi2基因的特異性分子標記，并利用該標記檢測發(fā)現(xiàn)23份水稻不育系均不含Pi2，但能準確跟蹤4個Pi2基因改良后代的基因型，顯示了HRM基因檢測的高效性及準確性。王平等[9]利用HRM技術開發(fā)了香味基因fgr，稻瘟病抗性基因Pita及Pik功能標記，并利用這些標記分析了46份水稻三系不育系的基因型。Wang等[17]在粳稻品種koshihikari和秈稻guichao2中鑒定了一個miRNA前體osa-MIR2923a中存在一個G/A多態(tài)性，利用HRM技術對兩個材料衍生的重組自交系群體進行了多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)種子長度和該多態(tài)顯著相關。Shabanimofrad等[2]為篩選抗稻飛虱基因連鎖標記，用HRM技術從110對SSR標記中篩選出57個多態(tài)標記，并篩選到2個連鎖的SSR標記。將水稻抗飛虱基因連鎖的SSR標記用HRM技術進行了檢測。

3.3?基因編輯后代等突變體鑒定

TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）技術是一種定向誘導基因組局部突變的技術。Li等[18]利用將HRM技術對水稻伽馬射線誘發(fā)TILLING突變體庫后代進行了高通量的篩選，發(fā)現(xiàn)以4株M2植株混合一個池進行檢測效果最佳。在4560個M2中，對OsLCT1和SPDT等2個基因篩選到包括G突變A的SNP、單堿基缺失及3堿基缺失等多種類型的突變。傳統(tǒng)TILLING后代突變體篩選是基于酶切結合聚丙烯酰胺凝膠電泳的方式，比較耗費時間和精力。HRM技術在TILLING上應用極大地提高了檢測效率。類似地，Lochlainn等[19]在白菜的TILLING突變后代中也利用HRM技術。由于基因編輯技術的發(fā)展，在水稻等基因組明確、遺傳轉化體系完善的作物上可以實現(xiàn)基因的定點突變，但對不能遺傳轉化，基因組信息未充分闡明的作物上，TILLING技術仍然是獲得特定基因突變體的重要手段和方式。HRM技術在TILLING上應用極大提高了突變檢測的效率[20]。

由于HRM技術的能區(qū)分包括SNP和InDel在內的各種類型的多態(tài)性，并且無需已知突變信息的特點，非常適合用于基因編輯后代等突變體鑒定篩選工作。姜明君等[21]利用HRM技術分析了TALEN定點突變水稻苯達松抗性基因CYP81A6的后代，從110株T0代轉化苗中篩選到3株突變體，和其他基因編輯后代檢測方式如酶切、測序等相比較，HRM能以較低的成本完成高效的突變體篩選工作，并且不受突變位點是否存在限制性酶切位點等特征的限制。

4?結論與展望

HRM技術由于其操作簡便、通量較高、結果準確可靠、成本低廉等諸多優(yōu)點越來越受到重視，并得到廣泛的應用。而水稻是我國重要的糧食作物，也是植物領域的模式植物。我國近年來在水稻功能基因發(fā)掘與鑒定方面取得了重要的突破[22-23]，為水稻的分子育種提供了堅實的基礎。由于在實施HRM分析時需要優(yōu)化擴增片段大小、反應參數(shù)等以使得擴增具有較強的特異性，因此有必要針對控制水稻重要農藝性狀的功能基因開發(fā)基于HRM技術的分子標記，以方便廣大分子育種工作者開展諸如種子資源鑒定、定向改良等工作。另外也有必要開發(fā)一套覆蓋全基因組的背景標記，建立基于HRM技術分子標記公共數(shù)據(jù)庫，加速水稻分子育種工作。

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（責任編輯：柯文輝）