基于超高效液相色譜法和色差儀法的黃芩藥材質(zhì)量評價

袁杰 李錟 周利 蔣待泉 梁玖雯 杜用璽 曾燕 王升 郭蘭萍

摘要 目的：通過對不同黃芩藥材的化合物含量和色度的測定，評價藥材質(zhì)量。方法：采用超高效液相色譜法（UPLC）測定黃芩化合物含量，同時采用色差儀法測定藥材色度。結果：不同產(chǎn)地和等級黃芩的黃芩苷含量存在一定的差異，并且黃芩粉末顏色與其等級有較明顯關系。結論：超高效液相色譜法和色差儀法可為評價黃芩藥材質(zhì)量提供參考。

關鍵詞 黃芩;超高效液相色譜;色差儀法;質(zhì)量評價

Quality Evaluation of Scutellaria baicalensis Georgi Based on UPLC and Colorimetry

Yuan Jie1，2，Li Tan1，Zhou Li1，Jiang Daiquan1，Liang Jiuwen1，Du Yongxi1，Zeng Yan3，Wang Sheng1，Guo Lanping1

（1 State Key Laboratory of Dao-di Herbs Breeding Base，National Resource Center for Chinese Meteria Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2 School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 3 China National Traditional Chinese Medicine Co.， Ltd.， Beijing 100195，China）

Abstract Objective：To evaluate the quality of Scutellaria baicalensis Georgi by determining the content of different bathes and its colorimetry compounds.Methods：Ultra performance liquid chromatography（UPLC）was used to determine the contents of Scutellaria baicalensis Georgi and the chromaticity of Scutellaria baicalensis Georgi was determined by colorimetry.Results：The content of baicalin in Scutellaria baicalensis Georgi from different areas and grades were different，and the chromaticity of Scutellaria baicalensis Georgi powder was obviously related to its grades.Conclusion：The method of UPLC and Colorimetry can provide reference for evaluating the quality of Scutellaria baicalensis Georgi.

Key Words Scutellaria baicalensis Georgi; UPLC; Colorimetry; Quality evaluation

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.006

黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi），為唇形科黃芩屬植物黃芩的干燥根，主要分布在山西、河北、河南、內(nèi)蒙古等地，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效，常應用于治療暑濕、胸悶嘔惡、黃疸瀉痢、肺熱咳嗽、臃腫瘡毒、胎動不安等?，F(xiàn)代研究顯示，黃芩中含有黃酮類、氨基酸類、有機酸類等多種活性成分，其中主要以黃芩苷為主[1-5]。

近年來，隨著黃芩新的藥效作用的不斷發(fā)現(xiàn)，市場對其需求量不斷增大，當前，黃芩的種植范圍逐步擴大，但是由于環(huán)境或是技術的限制，其質(zhì)量參差不齊，直接影響到與黃芩有關的中藥產(chǎn)品療效[6-8]。因此，采用一些手段對不同來源黃芩的質(zhì)量進行評價顯得尤為重要。許多研究都認為優(yōu)質(zhì)黃芩外觀具有根條粗長、體質(zhì)堅實、內(nèi)色鮮黃的特征，2018年由中華中醫(yī)藥學會發(fā)布的《中藥材商品規(guī)格等級》中將黃芩分為栽培和野生2個規(guī)格，其中一等選貨栽培黃芩：直徑≥1.5 cm，長度≥10 cm;二等選貨栽培黃芩：直徑范圍1.0～1.5 cm，長度≥10 cm;三等選貨栽培黃芩：直徑范圍0.7～1.0 cm，長度范圍5～10 cm;選貨黃芩為除去一等、二等、三等以外的選貨栽培黃芩;統(tǒng)貨黃芩為不分大小的栽培黃芩;野生統(tǒng)貨黃芩為枯芩，表面粗糙，棕黃色或深黃色，中心枯朽狀或已成空洞，氣微、味苦[9-11]。

基于此，本研究認為可根據(jù)黃芩的性狀并結合其有效成分的含量作為評價黃芩質(zhì)量優(yōu)劣的依據(jù)，即采用分光測色儀[12]和超高效液相色譜（UPLC）[13-14]分別檢測不同產(chǎn)地和等級黃芩色度以及7種黃酮類化合物含量，以期評價不同產(chǎn)區(qū)和等級黃芩藥材質(zhì)量，同時為建立高品質(zhì)黃芩藥材道地產(chǎn)區(qū)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ACQUITY UPLCTM I-CLASS系統(tǒng)（Waters公司，美國，型號UPLC I-class）;SB-800 DTD型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號SB-800-DTD）;New Classic MS-S電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司，型號XS105）;Eppendorf 5810R離心機（Eppendorf公司，德國，型號5810R）;CM-700D便攜式分光測色儀（也稱色差儀）（Konica Minolta，日本，型號CM-700D）。

1.2 試藥 于上海源葉生物科技有限公司購買黃芩苷對照品、漢黃芩苷對照品、黃芩素對照品、漢黃芩素對照品、野黃芩苷對照品、千層紙素對照品，批號分別為P20A9F59353、R27M10F89336、C04D8Y49741、W30M10Z84622、Z01M10X81701、Y31M9H62597。于中國食品藥品檢定研究院購買芹菜素對照品，批號為111901-201102。于美國默克公司購買色譜純甲醇，批號為I1003307913。于賽默飛世爾科技（中國）有限公司購買甲酸試劑，批號為186260。實驗室自制蒸餾水。

1.3 分析樣品 河北、內(nèi)蒙古、山西、山東、陜西，5個省區(qū)21個產(chǎn)地（縣/市）藥材收購商/合作社樣本48份樣品。見表1。

2 方法與結果

2.1 色度檢測方法 取不同產(chǎn)地和等級的黃芩粉末樣品（過2號篩），平鋪于粉末測試盒內(nèi)，用色差儀的測試口對準粉末測試盒，測定粉末的顏色，隨機掃描10次，取平均值。

2.2 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流動相A：0.2%甲酸水，流動相B：甲醇;流速：0.3 mL/min;進樣量：1 μL;柱溫：40 ℃;檢測波長：254 nm;梯度洗脫：0～5 min，流動相B 20%→31%;5～6 min，流動相B 31%→32%;6～8 min，流動相B 32%→32.5%;8～9 min，流動相B 32.5%→37%;9～10 min，流動相B 37%→40%;10～17.5 min，流動相B 40%→44%;17.5～18 min，流動相B 44%→45%;18～18.5 min，流動相B 45%→50%;18.5～22.5 min，流動相B 50%→63%;22.5～26 min，流動相B 63%→80%;26～27 min，流動相B 80%→20%;27～29.5 min，流動相B 20%→20%。在這個色譜條件下獲得黃芩樣品UPLC圖譜和混合對照品UPLC圖譜。見圖1、圖2。

2.3 對照品溶液的配制 精密稱取野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、芹菜素、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素對照品適量，分別用甲醇配成濃度為1 mg/mL的單一成分對照品貯備液。分別精密量取上述單一對照品貯備液適量，用甲醇稀釋成含有野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、芹菜素、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的配制 精密稱取樣品細粉15 mg，置于2 mL離心管中，精密加入70%甲醇1.5 mL，95%功率超聲提取30 min，轉速9 746 r/min離心10 min后，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，將續(xù)濾液稀釋10倍即得供試品溶液。

2.5 線性關系考察 將各個對照品儲備液稀釋成不少于5個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，按2.2項下條件測定峰面積。以色譜峰峰面積Y為縱坐標，進樣濃度X（μg/mL）為橫坐標得到回歸方程、線性范圍與相關系數(shù)。見表2。

2.6 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液，連續(xù)重復進樣6次，測得野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、芹菜素、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素的峰面積的RSD分別為1.67%、1.55%、1.82%、1.60%、1.19%、1.12%、1.24%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份藥材供試品溶液分別在放置0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h后進樣測定，測得野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、芹菜素、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素的峰面積的RSD分別為2.48%、2.25%、1.05%、2.40%、2.88%、2.92%、2.55%，表明各目標成分在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗 取同一樣品6份，按2.4項下方法制備供試品溶液，測得野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、芹菜素、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素的峰面積的RSD分別為2.98%、2.80%、2.43%、2.68%、1.99%、2.89%、2.80%，表明該實驗方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取同一批黃芩樣品6份，分為3組，分別加入適量的高、中、低濃度混合對照品溶液，分別測定各目標成分的含量，考察各目標成分的回收率。各目標成分野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、芹菜素、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素的平均加樣回收率分別為98.13%、95.95%、102.85%、103.36%、104.02%、103.61%、99.75%，其RSD分別為2.70%、0.69%、1.31%、0.88%、0.72%、1.06%、1.15%。

2.10 樣品測定結果

2.10.1 黃芩樣品色度結果 48批不同產(chǎn)地和等級黃芩樣品色度檢測后對測定結果進行頻率分布直方圖以及相關性分析，結果見圖3-a、圖3-b、圖3-c、表3及表4。

L*為亮度值，L*越大，亮度越高。由圖3-a可知L*值呈較明顯正態(tài)分布曲線，在（31.48～33.15）處分布最多。其中亮度值最大的黃芩為10號樣品，亮度值為39.85，來源于內(nèi)蒙赤峰，亮度值最小的黃芩為27號樣品，亮度值為23.11，來自于山東萊蕪蒙陰縣。因此可認為當我們從一批黃芩樣品中隨機抽取一個黃芩，該黃芩的L*值有較大概率處于（31.48～33.15）。

a*為紅綠色軸，a*值越大越紅，越小則越綠。由圖3-b可知a*值較大部分分布在（1.56～3.71），其中可認為河北產(chǎn)地的黃芩粉末在a*值上普遍偏低。而山西的黃芩粉末在a*值一直處于中等偏上的水平。其中a*值最大的黃芩為陜西渭南的選貨黃芩，a*值為5，a*值最小的黃芩樣品為內(nèi)蒙赤峰的二等黃芩，a*值為0.7。

b*為黃-藍色軸，b*值越大越黃，越小則越藍。由圖3-c可知較多的黃芩粉末處于（19.66，20.89），且當b*值在29.53以上時，就無黃芩粉末出現(xiàn)該值以上范圍。其中b*值最大的黃芩樣品為山東濟南的二等黃芩，b*值為29.53，b*值最小的黃芩樣品為山東萊蕪蒙陰縣的選貨黃芩，b*值為17.19。

由表3來看L*值于a*值呈現(xiàn)極顯著負相關，而L*值和b*值呈現(xiàn)極顯著正相關，且a*值于b*值呈極顯著負相關，即黃芩粉末亮度越高，粉末顏色越黃。由表4來看，a*值和黃芩等級呈現(xiàn)極顯著正相關，b*值和黃芩等級數(shù)值呈現(xiàn)顯著負相關關系，即可初步認為黃芩的大小與直徑和其粉末顏色有較明顯關系，也就是說該粉末如果越黃，越偏向紅色，則可認為該黃芩等級較高，而如果該黃芩顏色偏綠，較傾向于藍色，則可認為該黃芩等級較低。

2.10.2 黃芩樣品化合物含量結果 48批黃芩樣品黃酮類化合物檢測后對測定結果進行分析，結果見圖4、圖5及圖6。經(jīng)檢測黃芩中野黃芩苷含量范圍為0.665 0～2.609 0 mg/g，平均含量為1.603 7 mg/g;黃芩苷含量范圍為89.527 8～156.381 1 mg/g，平均含量為121.901 7 mg/g;漢黃芩苷含量范圍為18.876 9～37.591 6 mg/g，平均含量為28.804 0 mg/g;芹菜素含量范圍為0.569 7～0.861 1 mg/g，平均含量為0.715 1 mg/g;黃芩素含量范圍為2.976 8～31.213 7 mg/g，平均含量為10.597 9 mg/g;漢黃芩素含量范圍為0.439 2～7.004 1 mg/g，平均含量為2.539 6 mg/g;千層紙素含量范圍為0.213 9～3.609 1 mg/g，平均含量為1.223 7 mg/g。

圖4可知測定的這些化合物中黃芩苷含量最高，芹菜素不易檢出且含量較低。從圖5中可知，山東的黃芩中黃芩苷平均含量相對最高，達到135.740 8 mg/g。從圖6中可知，所有黃芩的黃芩苷含量普遍較高，均符合藥典對黃芩苷含量的規(guī)定，其中三等黃芩的黃芩苷含量最高，枯芩中黃芩苷含量最低。

接著對黃芩中黃酮類化合物與色度進行相關性分析。見表5。從表5中可知野黃芩苷含量與漢黃芩苷含量存在極顯著正相關，黃芩苷含量與漢黃芩苷含量存在極顯著正相關，黃芩苷含量和漢黃芩苷含量與黃芩素含量、漢黃芩素含量和千層紙素含量存在極顯著負相關，黃芩素含量與漢黃芩素和千層紙素含量存在極顯著正相關，漢黃芩素含量與千層紙素含量存在極顯著正相關。有意思的是，野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷代表的是糖苷類化合物，而黃芩素、漢黃芩素、千層紙素代表的是一類苷元類化合物，這2類化合物在黃芩樣品中以相反的形式增加或減少，推測可能存在著2類化合物的相互轉化。

除此以外，在表5中，黃芩苷和漢黃芩苷含量與a*值存在極顯著負相關，并且與b*值存在極顯著正相關;漢黃芩苷含量與L*值存在極顯著正相關;黃芩素、漢黃芩素、千層紙素含量與a*值存在極顯著正相關，并且與L*值和b*值存在極顯著負相關。表明當a*值一樣，粉末越黃時或是當b*值一樣，粉末越傾向于綠時，黃芩中主要黃酮類化合物黃芩苷含量越高，即含有糖苷的黃酮類化合物含量越高，不含糖苷的黃酮類化合物含量越低。

3 討論

本研究建立了UPLC方法測定中藥黃芩中7種黃酮類化合物含量的方法，由實驗結果可知，雖然不同產(chǎn)地不同等級的黃芩藥材中黃芩苷含量存在著一定的差異，但是這些黃芩藥材中黃芩苷含量均符合藥典規(guī)定，特別是山東地區(qū)高等級黃芩的黃芩苷含量較高，表明可能是氣候特征、土壤、光照強度、種植技術等因素的差異。

同時黃芩藥材中各成分含量存在著一定的相關性，表明中藥功效并不是由單一成分決定的，而是由多種成分共同相互作用的[15]。而且結合黃芩粉末色度進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，黃芩粉末外觀越黃，其主要有效成分黃芩苷含量越高，因此UPLC法和色差儀法可作為我們評價黃芩藥材質(zhì)量的有效方式。

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（2019-10-15收稿 責任編輯：王明）

基金項目：國家自然科學基金項目（81891014，81703648）;國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFC1700701，2017YFC1701405）;中國中醫(yī)科學院重點領域（ZZ10-027）;財政部中央本級專項（2060302）;中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金資助項目（ZZ13-YQ-084）作者簡介：袁杰（1995.10—），男，碩士研究生，研究方向：中藥資源，E-mail：1458251186@qq.com通信作者：王升（1988.04—），女，博士，助理研究員，研究方向：中藥資源，E-mail：mmcniu@163.com;郭蘭萍（1969.08—），女，博士，研究員，研究方向：中藥資源，E-mail：glp01@126.com