UPLC-MS/MS法測(cè)定不同產(chǎn)地何首烏中6種水溶性維生素含量

周利 郭蘭萍 高峰 李佳興 余意 馬方勵(lì) 楊健

摘要 目的：建立超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS/MS）測(cè)定何首烏中水溶性維生素類(lèi)成分的分析方法。方法：將粉碎后的何首烏樣品用超純水超聲提取后，經(jīng)ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）分離并在動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）下檢測(cè)，得到相應(yīng)的提取離子流圖，以峰面積進(jìn)行定量。結(jié)果：何首烏中6個(gè)水溶性維生素的含量差別較大，其中VB4為何首烏中維生素的主要來(lái)源，在6個(gè)維生素類(lèi)化合物中的含量最高，達(dá)到85.89 μg/g;VB6平均含量最低，僅為0.68 μg/g。其余4種維生素類(lèi)成分VB2、VB5、NA和NAM的平均含量均相對(duì)較低。結(jié)論：該法簡(jiǎn)單快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，重復(fù)性好，為何首烏中水溶性維生素類(lèi)成分的深入研究以及何首烏保健產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 何首烏;水溶性維生素;超高效液相-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用;含量分析

Determination of 6 Water-Soluble Vitamins in Polygoni Multiflori Radix from Different Habitants by UPLC-MS/MS

Zhou Li1，Guo Lanping1，Gao Feng2，Li Jiaxing1，Yu Yi3，Ma Fangli3，Yang Jian1

Abstract Objective：To establish an Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Mass/Mass Spectrometry（UPLC-MS/MS）method to determine the contents of water-soluble vitamins in Polygoni Multiflori Radix from different habitants.Methods：The pulverized Polygoni Multiflori Radix sample was ultrasonically extracted with ultrapure water，separated by an ACQUITY UPLC BEH C18 column（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）and detected under dynamic multiple reaction monitoring mode（MRM）to obtain the corresponding extracted ions Flow chart，and quantified by peak area.Results：The contents of 6 water-soluble vitamins in Polygoni Multiflori Radix had great differences.Among them，the content of VB4 was the highest which was 85.89 μg/g; and the content of VB6 was the lowest which was only 0.68 μg/g.The average content of the other 4 vitamins，VB2，VB5，NA and NAM，was relatively low.Conclusion：The method is simple，accurate and reproducible.It provides a reference for the follow-up research of water-soluble vatamins and health food development of Polygoni Multiflori Radix.

Key Words Polygoni multiflora Radix; Water-soluble vitamins; UPLC-MS/MS; Content analysis

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.008

何首烏為蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥塊根，味苦、甘、澀，性微溫，歸肝、心和腎經(jīng)[1]，是一種常用補(bǔ)益中藥，最早載于《日華子本草》，曰：“其藥本草無(wú)名，因何首烏見(jiàn)藤夜交，便即采食有功，因以采人為名耳”[2]。何首烏另有地精、仙藥、首烏等別名，生用可解毒、消癰、潤(rùn)腸通便，制用能補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、益精血、烏須發(fā)，歷來(lái)被古今醫(yī)家、食療養(yǎng)生家所推崇，在醫(yī)療、保健、化工等領(lǐng)域占有重要地位[3-4]。目前何首烏生品及炮制品均已納入我國(guó)保健食品原料名錄。

維生素又名維他命，是維持人體正常功能不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是保持機(jī)體健康不可缺少的活性物質(zhì)。研究表明，維生素缺乏將會(huì)導(dǎo)致包括皮炎、脫屑、口腔潰瘍、壞血病、兒童佝僂病等在內(nèi)的一系列癥狀及疾病，同時(shí)，維生素對(duì)一些疾病也有一定的治療作用，如研究表明，葉酸、維生素能夠降低腦梗死患者血中HCY的水平，降低患者死亡率[5];維生素C可作為電子供體在細(xì)胞中產(chǎn)生過(guò)氧化氫殺傷腫瘤細(xì)胞，在腫瘤治療中具有廣闊前景[6-7]。作為一種重要的功能因子，維生素是各類(lèi)食品，醫(yī)療、保健品原料的重要檢測(cè)指標(biāo);而其在何首烏中的含量卻鮮有報(bào)道。本研究以超高效液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）建立了同時(shí)測(cè)定何首烏中6種水溶性維生素成分維生素B2（VB2）、維生素B4（VB4）、維生素B5（VB5）、維生素B6（VB6）、煙酸（NA）和煙酰胺（NAM）的方法，并以不同產(chǎn)地來(lái)源的15批何首烏樣品為研究對(duì)象，對(duì)其所含的該類(lèi)成分的含量水平進(jìn)行了分析及評(píng)價(jià)，以期為何首烏的深入研究及保健產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ACQUITY UPLCTM系統(tǒng)（Waters公司，美國(guó)，型號(hào)：I-Class），API四級(jí)桿-線性離子阱質(zhì)譜儀（ABSCIEX公司，配有離子噴霧接口，美國(guó)，型號(hào)：6500），電子天平（梅特勒-托利多有限公司，瑞士，型號(hào)：NewClassic MF），超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號(hào)SB800DTD），Eppendorf離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)，型號(hào)：5810R）。

1.2 試劑 色譜級(jí)甲醇和乙腈（Fisher Scientific公司，美國(guó)，I1014107923、JB081430）;乙酸銨（LC/MS分析用，F(xiàn)isher Scientific公司，美國(guó)，批號(hào)A639-500）;水為自制超純水，來(lái)至賽默飛超純水系統(tǒng)（電阻率為18.2 M/cm，美國(guó)，型號(hào)GenPure）。對(duì)照品：維生素類(lèi)化合物對(duì)照品共6個(gè)，分別為：維生素B2（VB2，批號(hào)B21290）、維生素B4（VB4，批號(hào)18108459072）、維生素B5（VB5，批號(hào)B21291）、維生素B6（VB6，批號(hào)B21292）、煙酸（NA，批號(hào)BCBH1877V）、煙酰胺（NAM，批號(hào)J16N8R47789）。其中維生素B2、煙酸、煙酰胺和維生素B5購(gòu)買(mǎi)于北京北京融誠(chéng)鑫德科技發(fā)展有限公司;維生素B4和維生素B6購(gòu)買(mǎi)于上海士峰生物科技有限公司。以上對(duì)照品純度均大于98%。

1.3 分析樣品 本研究所用何首烏采自四川、廣東、云南等何首烏主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心金艷鑒定為蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥塊根，采集具體信息見(jiàn)表1。

2 方法

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）;流動(dòng)相A：10 mmol/L乙酸銨，流動(dòng)相B：乙腈，流速：0.5 mL/min;進(jìn)樣量：1 μL，柱溫：40 ℃，梯度洗脫：0～1.5 min，流動(dòng)相A 95%→95%;1.5～4 min，流動(dòng)相A 95%→45%;4～4.5 min流動(dòng)相A 45%→95%;4.5～6 min，流動(dòng)相A 95%→95%。

2.2 質(zhì)譜條件 離子源：Turbo V;電離模式：ESI+;氣簾氣（CUR）體積流量：30 L/min，;噴霧電壓（IS）：5500 V;霧化氣（GS1）體積流量：50 L/min;加熱輔助氣（GS2）體積流量：50 L/min;采集方式：MRM;離子化溫度（TEMP）：550 ℃。優(yōu)化的條件參數(shù)見(jiàn)表2。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取維生素類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品適量，制備成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，其中維生素B2用10%的氨水為溶劑配成單一成分對(duì)照品儲(chǔ)備液，其他維生素用10 mmol/L乙酸銨：甲醇（9∶1）的溶液為溶劑分別配成單一成分對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，分組配制成適量濃度的各混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中維生素B2為第1組，維生素B4、維生素B5和煙酸為第2組，維生素B6和煙酰胺為第3組。

2.4 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取樣品粉末50 mg，置于離心管中，精密加入超純水1.5 mL，稱(chēng)定重量，超聲提取30 min（功率：250 W，頻率：40 kHz），再稱(chēng)定重量，用超純水補(bǔ)足減少的質(zhì)量，12 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。放置于4 ℃冰箱供UPLC-MS/MS分析用。

2.5 線性關(guān)系考察

取上述3組混合對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋為7個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)曲混標(biāo)溶液，采用2.2和2.3項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，以色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)得到回歸方程、線性范圍與相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，6種目標(biāo)成分在各自的濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.6 中間精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各目標(biāo)化合物峰面積的RSD范圍為0.54%～2.67%，證明儀器精密度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、1、2、3、6 h進(jìn)樣，以測(cè)定化合物穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，各維生素類(lèi)化合物在6 h內(nèi)測(cè)定值的RSD在2.32%～3.87%之間，證明化合物穩(wěn)定性良好，滿足分析需要。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一份何首烏樣品，精密稱(chēng)定6份，按本研究所述提取方法提取完成并過(guò)濾測(cè)定。結(jié)果顯示，各目標(biāo)化合物測(cè)定值的RSD在1.78%～4.37%之間，證明方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取何首烏樣品5份，向其中加入一定質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。按照2.4項(xiàng)方法處理后進(jìn)樣分析，以計(jì)算所得的實(shí)際值與加入量的比值即為回收率。6個(gè)維生素的平均加樣回收率：維生素B2為95.3%，維生素B4為102.9%，維生素B5為96.2%，煙酸為104.3%，煙酰胺為95.8%，維生素B6為105.6%，其RSD均小于6.0%。

2.11 樣品的測(cè)定結(jié)果 取各產(chǎn)地何首烏供試品溶液，按照優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及實(shí)際稱(chēng)樣量進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)而得到樣品中各化合物的含量。見(jiàn)表4。

3 討論

不同產(chǎn)地何首烏維生素的總含量在52.97～186.50 μg/g之間，平均含量為108.13 μg/g。其中VB4為何首烏中維生素的主要來(lái)源，在6個(gè)水溶性維生素中的含量最高，平均值達(dá)到85.89 μg/g;VB6平均含量最低，僅為0.68 μg/g。其余4種維生素類(lèi)化合物在何首烏中的含量均分布在0～10 μg/g之間，VB2、NAM、VB5和NA的平均含量依此為8.41 μg/g、6.67 μg/g、3.25 μg/g和3.23 μg/g。

不同產(chǎn)地來(lái)源的樣品中，以廣西玉林何首烏中維生素總量最高，達(dá)到186.50 μg/g，其次是廣東高州產(chǎn)何首烏，其維生素總含量為177.79 μg/g;此外，分別來(lái)自四川達(dá)州、四川宜賓、四川遂寧和貴州凱里的樣品中維生素類(lèi)成分總含量均達(dá)到100 μg/g以上，分別為157.62 μg/g、122.29 μg/g和127.29 μg/g。其余產(chǎn)地藥材中維生素總量均低于100 μg/g，最低的為安徽亳州產(chǎn)樣品，僅為52.97 μg/g，為廣西玉林何首烏總維生素含量的28.40%。

本研究還同時(shí)檢測(cè)了何首烏中的VB1、VC、VB7和VB8 4種成分，但此4種成分在何首烏藥材中均未檢出。研究利用UPLC-MS/MS法測(cè)定了不同產(chǎn)地何首烏藥材中6種水溶性維生素成分的含量。該法簡(jiǎn)單快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，重復(fù)性好，為何首烏后續(xù)的相關(guān)研究提供了參考依據(jù)。

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（2019-10-15收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：財(cái)政部中央本級(jí)專(zhuān)項(xiàng)（2060302）;國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81603241）;國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1700701）作者簡(jiǎn)介：周利（1992.10—），女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：中藥材質(zhì)量分析與評(píng)價(jià)，E-mail：zhouli3131@163.com通信作者：楊健（1981.07—），男，博士，副研究員，研究方向：中藥資源，E-mail：yangchem2012@163.com