牛角瓜離體快繁技術(shù)

蘇江　何金祥　冼康華　付傳明　黃惠錦　黃寧珍

摘要：? 該文選用牛角瓜莖段為外植體，通過組織培養(yǎng)方法探索牛角瓜組織培養(yǎng)和種苗快繁技術(shù)。結(jié)果表明：最佳外植體表面消毒方法是以0.1% HgCl2處理7 min，外植體存活率為32.3%;初代培養(yǎng)基為MS+ 蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂3.5 g·L-1，培養(yǎng)20 d后形成3～4 cm高的再生芽。增殖培養(yǎng)前期篩選的較為適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂3.5 g·L-1，增殖系數(shù)4.6。但在后續(xù)的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，牛角瓜組培苗易玻璃化，且隨著世代更迭，玻璃化程度加重，到了第四代幾乎全部玻璃化。因此在上述增殖培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，以AgNO3作為玻璃化抑制劑，篩選出最終的增殖培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1+ AgNO3 1.0 g·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂3.5 g·L-1。用此增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)25 d，苗高5～8 cm，增殖系數(shù)5.8，玻璃化率低于10%，且連續(xù)培養(yǎng)多代，玻璃化率維持在10%以下。生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+ NAA 1.0 mg·L-1+ 蔗糖20 g·L-1+ 瓊脂3.6 g·L-1，培養(yǎng)14 d，生根率98%;將生根苗移栽于70%遮陰度的大棚中，30 d后，苗高20 cm左右，成活率85%。利用該方法可對牛角瓜優(yōu)良種苗進行規(guī)模化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞： 牛角瓜， 組織培養(yǎng)， 培養(yǎng)基

中圖分類號：? Q943.1文獻標(biāo)識碼：? A文章編號：? 1000-3142（2019）12-1648-08

Abstract：? Tissue culture and rapid propagation technique of Calotropis gigantea was studied by using stem segments as explants in this paper. The results showed that the optimal sterilization method of explants was to treat 7 min with 0.1% HgCl2， and the survival rate of explants was 32.3%. The suitable primary induction medium was MS+ sucrose 30 g·L-1+ ager 3.5 g·L-1. And after 20 d culture， 3-4 cm high regenerative buds were formed. Pre-multiplication culture test showed that MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1+ sucrose 30 g·L-1+ ager 3.5 g·L-1 was a suitable multiplication medium， and proliferation coefficient was 4.6. However， during the subsequent culture process， the seedlings were easy to vitrify by using this method. With the change of generation， the vitrification rate increased， and it nearly reached 100% on the fourth generation. Therefore， inhibition of vitrification was the key to succeed. Based on the above multiplication culture treatment， with AgNO3 as a vitrification inhibitor， the suitable multiplication culture medium of MS+6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1+ AgNO3 1.0 g·L-1+ sucrose 30 g·L-1+ ager 3.5 g·L-1 was verified. With this method， 25 d later， seedling height was 5-8 cm， and proliferation coefficient was higher than 5.8 and vitrification rate of multiple shoots was lower than 10%. The optimal medium for rooting was 1/2MS+ NAA 1.0 mg·L-1+ sucrose 20 g·L-1 + ager 3.6 g·L-1， and 14 d later， the rooting rate was 98%. The rooting seedlings were transplanted in the 70% shading greenhouse. And 30 d later， they were about 20 cm high， with 85% survival rate. This method can be used for the large-scale production of excellent clonal seedlings of Calotropis gigantea.

Key words： Calotropis gigantea， tissue culture， medium

牛角瓜（Calotropis gigantea）為蘿藦科牛角瓜屬灌木，在我國主要分布于云南、四川、廣西和廣東等地區(qū)，多生長于低海拔向陽山坡、曠野地及海邊，其在干熱河谷、鹽堿地等生境下適應(yīng)能力較強，可起到改善生態(tài)環(huán)境的作用。近年來，隨著國內(nèi)外學(xué)者對牛角瓜的深入研究，發(fā)現(xiàn)了牛角瓜多種應(yīng)用開發(fā)價值。牛角瓜纖維密度為0.9 g·cm-3，是自然界質(zhì)量最輕的纖維（Maity et al.，? 2014）。將牛角瓜纖維與傳統(tǒng)棉纖維和木棉纖維的直徑、長度和成分對比發(fā)現(xiàn)，牛角瓜絨的結(jié)構(gòu)類似于木棉纖維且具有更優(yōu)良的機械性能，牛角瓜絨與棉的混紡紗能夠滿足服飾的基本要求（費魏鶴等，2011）。因此，牛角瓜纖維被譽為繼棉花纖維又一具有廣泛應(yīng)用前景的新型天然植物纖維（李瑞等，2007;費魏鶴等，2011;高靜等，2012;方國平等，2014）。研究證實，牛角瓜全株富含白色乳汁，有毒但具有藥用價值。從牛角瓜乳汁中提取的牛角瓜苷等物質(zhì)具有強心作用（鄧士賢等，1962;戴好富等，2009;高柱和王小玲，2011;田湘等，2015）;牛角瓜根及花的提取物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、退熱等作用（Kumar & Basu， 1994;Basu & Chaudhari，1991）;此外，牛角瓜的不同提取物還具有護肝、促進傷口愈合、抗氧化等多種作用（戴好富等，2009）。牛角瓜被稱為“石油植物”，其汁液中含有大量碳氫化合物及部分烴類物質(zhì)，與天然石油成分近似，其汁液中含有多種化學(xué)成分，印度產(chǎn)的牛角瓜植株中油脂含量為4.7%，熱值與原煤接近，被認為可用來開發(fā)液體燃料和有用化學(xué)品（Kalita & Saikia，2004;Sharma et al.， 1997）。由于牛角瓜生長速度快，每周可長30 cm，能多茬收獲，生物量大。因此，作為能源植物開發(fā)具有重要意義。綜上所述，經(jīng)過國內(nèi)外科研工作者的研究證實，牛角瓜在棉紡織領(lǐng)域、醫(yī)藥領(lǐng)域和生物質(zhì)能源開發(fā)領(lǐng)域等都具有重要的應(yīng)用價值。

野生牛角瓜主要以種子繁殖為主，基于牛角瓜重要的經(jīng)濟價值，應(yīng)在篩選優(yōu)良單株的基礎(chǔ)上進行無性繁殖，以保持母本的優(yōu)良性狀。常規(guī)的無性繁殖方法有扦插、嫁接、組培等，但想要在短時間內(nèi)進行快速大量的無性繁殖，則組培的方法更為快速有效。雖然牛角瓜組培技術(shù)目前已有報道，但研究相對較少，且有兩個影響產(chǎn)業(yè)效率的主要問題并未解決：一是牛角瓜組培苗增殖系數(shù)較低，僅為 3.9/25 d（唐軍榮等，2016）;二是牛角瓜組培快繁過程中極易玻璃化，且隨著繼代次數(shù)的增多，玻璃化加重，最終導(dǎo)致負增殖。本文針對這兩方面的問題對牛角瓜組培快繁增殖培養(yǎng)基配方進行研究和改進，得到該方法。

1材料與方法

1.1 植物材料

2015年9月，采集海南省海尾鎮(zhèn)牛角瓜的當(dāng)年生枝條。

1.2 外植體消毒、接種及初代培養(yǎng)

以牛角瓜當(dāng)年生枝條作為外植體，將外植體置于質(zhì)量濃度為1%的洗潔精水溶液中浸泡10 min，取出后用流水沖洗干凈，再置于超凈工作臺上用體積濃度為 70%的乙醇浸泡60 s，取出后置于質(zhì)量濃度為0.1%的HgCl2中浸泡滅菌，滅菌時間選取5 、6 、7和8 min 4個水平，最后用無菌水清洗 3～5 次。將經(jīng)過消毒處理的牛角瓜外植體裁剪成含有1或2個腋芽的莖段，將莖段接種到MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個處理30瓶，每瓶接種外植體1個，重復(fù)3次，每隔1周觀測記錄材料的生長狀況并剔除污染材料。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為（28±3）℃，光照時間為10～12 h·d-1，光照強度為40 μmol·m-2·s-1。

1.3 牛角瓜無菌芽的增殖培養(yǎng)

將初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中獲得的無菌幼苗剪成帶有1～2個腋芽的莖段，接種于含有不同濃度配比的6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中用于固化的瓊脂3.5 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，pH調(diào)至5.8。采取正交試驗設(shè)計，6-BA取0.5、1.0、1.5 mg·L-1三個水平，NAA取0.05、0.1、0.15 mg·L-1三個水平，每組處理接種60個莖段，重復(fù)3次，接種之后，每隔10 d觀測記錄材料的生長情況，培養(yǎng)25 d后，統(tǒng)計各個處理的增殖系數(shù)、長勢（葉片顏色、苗高及莖桿的粗細等）和玻璃化率等。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為（28±3） ℃，光照時間為10～12 h·d-1，光照強度為40 μmol·m-2·s-1。

1.4 牛角瓜組培苗玻璃化抑制試驗

在牛角瓜繼代增殖培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)從第一代開始即出現(xiàn)大量的玻璃化苗，嚴重影響牛角瓜繼代增殖。以上述篩選出的增殖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選用AgNO3作為玻璃化抑制劑進行牛角瓜玻璃化抑制試驗。試驗設(shè)計：AgNO3取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1五個水平，每組處理接種60個莖段，重復(fù)3次，接種后，培養(yǎng)25 d，統(tǒng)計各個處理的增殖系數(shù)、長勢（葉片顏色、苗高及莖桿的粗細等）和玻璃化率等。

利用上述篩選出來的優(yōu)選培養(yǎng)基進行繼代增殖培養(yǎng)，每25 d為一代，觀測每一代的玻璃化率，以確定此優(yōu)選配方是否能夠穩(wěn)定抑制牛角瓜組培苗的玻璃化。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為（28±3） ℃，光照時間為10～12 h·d-1，光照強度為40 μmol·m-2·s-1。

1.5 牛角瓜組培苗生根培養(yǎng)及煉苗移栽

選擇增殖培養(yǎng)所得的叢生苗和芽苗為生根材料，轉(zhuǎn)入含有不同濃度NAA的1/2MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)基中用于固化的瓊脂3.5 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，pH調(diào)至5.8。試驗所用NAA取0.5、1.0、1.5 mg·L-1三個水平，共設(shè)計3個處理，每個處理20瓶，每瓶接種牛角瓜無根苗10株，重復(fù)3次得到數(shù)據(jù)。接種后，培養(yǎng)14 d，觀測統(tǒng)計各處理幼苗的根數(shù)、根長、根毛、生根率及植株長勢等。

將牛角瓜生根苗置于70%遮陰度的大棚中煉苗3～5 d后，取出并洗凈根部培養(yǎng)基，移栽于裝有消過毒的移栽基質(zhì)（沙壤土∶腐殖土=2∶1）的營養(yǎng)杯（12 cm × 12 cm）中，在溫室大棚培養(yǎng)30 d后，即可移栽大田。

培養(yǎng)條件：溫度為（28±3） ℃，光照時間為10～12 h·d-1，光照強度為40 μmol·m-2·s-1。

2結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒、接種與初代培養(yǎng)

牛角瓜外植體經(jīng)消毒滅菌接種于MS培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)3周后對結(jié)果進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，隨著升汞滅菌時間的延長，污染率逐漸下降，成活率先上升后下降，升汞處理7 min時成活率最高（表1）。對初代培養(yǎng)形成的幼苗進行觀察發(fā)現(xiàn)，升汞滅菌5～7 min，培養(yǎng)20 d左右幼苗高度都可以達到3～4 cm，且植株葉片鮮綠、莖稈相對較粗，能夠作為增殖培養(yǎng)的無菌材料;升汞滅菌時間達到8 min，部分幼苗莖稈纖細，腋芽數(shù)少，且葉片發(fā)黃。綜上所訴，牛角瓜外植體升汞最佳滅菌時間為7 min。

2.2 牛角瓜無菌芽的增殖培養(yǎng)

以6-BA（0.5～1.5 mg·L-1） 與NAA（0.05～0.15 mg·L-1）不同濃度配比進行第一代增殖培養(yǎng)，結(jié)果顯示在培養(yǎng)25 d后，各個處理組的苗高差異不明顯（圖1）; 增殖系數(shù)處理7（6-BA濃度1.5 mg·L-1、NAA濃度0.05 mg·L-1）最大，達到4.6，且植株健壯，葉片鮮綠，長勢強（表2和圖1）。從表2中還可以看出9個處理的玻璃化率都在30%左右，僅處理7與處理1有顯著差異，但處理1的增殖系數(shù)明顯低于處理7，因此認為處理7的組合為牛角瓜較為適宜的增殖培養(yǎng)基。

利用上述篩選出的增殖培養(yǎng)基配方MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1 + 蔗糖30 g·L-1+瓊脂3.5 g·L-1（pH 5.8）對牛角瓜進行增殖擴繁，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著繼代次數(shù)的增多，牛角瓜組培苗玻璃化程度加重（圖2），擴繁至第四代，幾乎全部玻璃化，因此抑制牛角瓜組培苗玻璃化是其快繁能否成功的關(guān)鍵。

2.3 牛角瓜玻璃化抑制試驗

以MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1 + 蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂3.5 g·L-1（pH 5.8）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別附加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1的硝酸銀作為玻璃化抑制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在添加硝酸銀的培養(yǎng)基中5個處理組的玻璃化率都降低到了10%以下，處理2、3、4、5之間差異不顯著;增殖系數(shù)方面，處理2與處理3之間差異不顯著，兩者和其他處理之間差異顯著（表3）。雖然處理3的增殖系數(shù)更高一些，但其所得的組培苗，莖稈細弱，葉片卷曲發(fā)黃; 處理2的植株， 莖稈較為粗壯， 葉片鮮綠（表2，圖3）。因此，處理2（MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1+ AgNO3 1.0 g·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂3.5 g·L-1）為牛角瓜繼代增殖的合適培養(yǎng)基。

以篩選出的優(yōu)選增殖培養(yǎng)基MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1+ AgNO3 1.0 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂3.5 g·L-1來進行連續(xù)多代的增殖培養(yǎng)。從表4可以看出，用此配方進行連續(xù)多代的增殖培養(yǎng)，玻璃化率一直維持在8%以下，增殖系數(shù)維持在5.6以上，且各世代之間差異不顯著。

2.4 牛角瓜生根培養(yǎng)與煉苗移栽

將高度4～5 cm的牛角瓜從生芽苗從基部剪下，轉(zhuǎn)入含有不同濃度NAA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1）的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，14 d后觀測結(jié)果及計算生根率， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個處理在生根數(shù)方面沒有顯著差異，而在根長和生根率方面均差異顯著，處理2生根率最高（達到98%），且在根長與生根數(shù)方面都優(yōu)于另外兩個處理（表5）。因此，確定含有NAA 1.0 mg·L-1的1/2MS培養(yǎng)基為較適宜牛角瓜組培苗生根的培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中，生根苗健壯，長出的根系潔白、有韌性，利于移栽（圖4）。

將牛角瓜生根苗置于70%遮陰度的大棚中煉苗3～5 d后，取出并洗凈根部培養(yǎng)基，移栽于裝有消過毒的移栽基質(zhì)（沙壤土∶腐殖土=2∶1）的營養(yǎng)杯（12 cm × 12 cm）中，在溫室大棚培養(yǎng)30 d后，苗高可達20 cm，成活率為85%。

3討論與結(jié)論

本研究通過牛角瓜帶腋芽的莖段為外植體進行組織培養(yǎng)研究，探索出了一套相對完整的牛角瓜組織培養(yǎng)和種苗快繁技術(shù)。牛角瓜外植體在進行消毒滅菌時，適宜的升汞滅菌時間為7 min，消毒存活率相對較低，為32.33%。可能的原因是牛角瓜屬于多漿植株，新生枝條含有豐富的乳汁且相對柔弱，用升汞進行滅菌時，剪口不易消毒清洗，圖 1牛角瓜無菌芽增殖培養(yǎng)表現(xiàn)造成滅菌不徹底，且升汞附著于傷口對植物體造成傷害。

在牛角瓜的繼代增殖培養(yǎng)研究中，李克烈等（2007）利用牛角瓜葉片愈傷組織誘導(dǎo)芽分化得到了較多的叢生芽;唐軍榮等（2016）利用牛角瓜頂芽為外植體進行培養(yǎng)，增殖系數(shù)最高為3.9。參考二者的研究，本研究對增殖培養(yǎng)配方進行了篩選和優(yōu)化，通過連續(xù)的多代培養(yǎng)研究證實，利用此配方進行牛角瓜的增殖快繁，增殖系數(shù)一直維持在5.6以上，相比于二者，增殖系數(shù)有了明顯的提高。另外，在牛角瓜增殖快繁過程中發(fā)現(xiàn)，未加入玻璃化抑制劑時，牛角瓜組培苗極易玻璃化，在研究過程中，僅培養(yǎng)到第四代，幾乎全部因為玻璃化而死亡。針對這一問題，該研究利用硝酸銀作為玻璃化抑制劑，研究篩選MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+AgNO3 1.0 mg·L-1 +蔗糖30 g·L-1+瓊脂3.6 g·L-1為適宜的增殖培養(yǎng)基。此配方在未加入硝酸銀時，增殖系數(shù)能夠達到4.6;添加1.0 mg·L-1的硝酸銀后，玻璃化率由33.9%降低到了6.11%，增殖系數(shù)由4.6增加到5.8，且連續(xù)多代培養(yǎng)，玻璃化率一直維持在8%以下，各世代之間差異不顯著。應(yīng)用此方法解決牛角瓜組培苗易玻璃化的同時維持牛角瓜增殖培養(yǎng)較高的增殖系數(shù)，為牛角瓜高效低成本的種苗組培快繁創(chuàng)造了有利條件。

在對牛角瓜組培苗生根培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，在含NAA的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，根長可達4～5 cm，生根數(shù)為5～8，生根率98%，但在移栽過程中發(fā)現(xiàn)，牛角瓜組培苗根系相對柔弱、根毛少，在進行清洗時很容易造成斷裂，這可能是影響后期移栽成活率的主要原因。因此，在進行生根培養(yǎng)時，在保證牛角瓜生根率的同時，應(yīng)采取合適的方法健壯牛角瓜根系。

參考文獻：

BASU A， CHAUDHURI AK， 1991. Preliminary studies on the antiinflammatory and analgesic activities of Calotropis procera root extract [J]. J Ethnopharmacol， 31（3）： 319-324.

DAI HF， WANG MY， MEI WL， et al.，? 2009. Research progress on phemical components and pharmacological activities of Calotropis R. Br [J]. J Henan Agric Univ （Med Sci Ed）， 28（1）： 1-7. [戴好富， 王茂媛， 梅文莉， 等， 2009. 牛角瓜屬植物化學(xué)成分與藥理活性研究進展 [J]. 河南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）， 28（1）：1-7.]

DENG SX， WANG MD， WANG DC， 1962. The cardiac effect and biological potency of calotropin [J]. Acta Pharm Sin， （11） ： 667-670. [鄧士賢， 王懋德， 王德成， 1962. 牛角瓜甙的強心作用及其生物效價 [J]. 藥學(xué)學(xué)報， （11） ： 667-670.]

FANG GP， HU HM， 2014. Akund fiber and its application in knitting [J]. Knitting Ind，? （5）： 26-30. [方國平， 胡惠民， 2014. 牛角瓜纖維及其在針織領(lǐng)域應(yīng)用初探 [J]. 針織工業(yè)， （5）：26-30.]

FEI WH， HU HM， LI X， et al.，? 2011. Study on the structure and property of akund fiber [J]. Chin fiber Inspect， （7）： 80-83. [費魏鶴， 胡惠民， 李璇， 等， 2011. 牛角瓜纖維的結(jié)構(gòu)與性能研究 [J]. 中國纖檢， （7）：80-83.]

GAO J， ZHAO T， CHEN JB， 2012. Composition， structure and property analysis of Calotropis gigantea L.， kapok and cotton fibers [J]. J Donghua Univ （Nat Sci Ed）， 38（2）： 151-155. [高靜， 趙濤， 陳建波， 2012. 牛角瓜、木棉和棉纖維的成分、結(jié)構(gòu)和性能分析 [J]. 東華大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 38（2）：151-155.]

GAO Z， WANG XL， 2011. Study on the development value and cultivation techniques of Calotropis gigantea L. [J]. N Hortic， （18）： 202-206. [高柱， 王小玲， 2011. 牛角瓜開發(fā)價值及栽培技術(shù)研究 [J]. 北方園藝， （18）：202-206.]

KALITA D， SAIKIA CN， 2004. Chemical constituents and energy content of some latex bearing plants [J]. Bioresour Technol， 92（3） ： 219-227.

KUMAR VL， BASU N， 1994. Anti-inflammatory activity of the latex of Calotropis procera [J]. J Ethnopharmacol， 44（2）： 123-125.

LI KL， LUO LZ， CHEN W， et al.，? 2007. Tissue culture of Ca-lotropis gigantea [J]. J Guangxi Agric Boil Sci， 26（3）： 247-249. [李克烈， 羅聯(lián)忠， 陳偉， 等， 2007. 牛角瓜的組織培養(yǎng) [J]. 廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)， 26（3）： 247-249.]

LI R， ZENG JL， WANG XD， et al.，? 2007. Energy-produced components in Calotropis gigantea L.? [J]. Chin J Proc Eng， （6）： 1217-1220. [李瑞， 曾建立， 王曉東， 等， 2007. 耐鹽堿植物牛角瓜產(chǎn)能成分分析 [J]. 過程工程學(xué)報， （6）： 1217-1220.]

MAITY S， MOHAPATRA HS， CHATTERJEE A， et al.，? 2014. The new generation natural fiber-akund floss [J]. Melliand Chin， 42（7）： 6-8.

SHARMA DK， TIWARI M， ARORA M， et al.，? 1997. Microbial transformation and biodegradation of Calotropis procera latex towards obtaining value added chemicals， pharmaceuticals and fuels [J]. Liq Fuels Technol， 15（1-2）： 137-169.

TANG JR， LI B， LIU HM， et al.，? 2016. A study on rapid propagation technology for Calotropis gigantea in vitro? [J]. J Yunnan Agric Univ （Nat Sci Ed）， 31（4）： 658-663. [唐軍榮， 李斌， 劉惠民， 等， 2016. 牛角瓜離體快繁技術(shù)研究 [J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 31（4）： 658-663.]

TIAN X， YAN L， TANG D， et al.，? 2015. Research hot spot and trend of development about the “Versatile Bush” Calotropis gigantea L. [J]. J Shanxi Agric Sci， 43（8）： 1061-1064. [田湘， 嚴理， 唐丹， 等， 2015. “全能灌木”牛角瓜研究熱點及發(fā)展趨勢 [J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)， 43（8）：1061-1064.]