小金膠囊的HPLC指紋圖譜建立及主成分分析

明凱利 向陽 楊艷霞 曾添 王丫頭 蔡威 朱雯

中圖分類號(hào) R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）02-0188-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.09

摘 要 目的：建立小金膠囊的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進(jìn)行主成分分析。方法：采用HPLC法。色譜柱為Agilent TC-C18（2），流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為240 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。以11-羰基-β-乙酰乳香酸為參照，繪制15批樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰，并采用Minitab 17.0軟件進(jìn)行主成分分析。結(jié)果：有1批樣品相似度小于0.800，且與其他14批樣品比較缺13、14、15號(hào)共有峰，可能存在質(zhì)量差異而未進(jìn)行相關(guān)分析。其余14批樣品的HPLC圖譜有15個(gè)共有峰，指認(rèn)了3個(gè)色譜峰，分別為槲皮素、穗花杉雙黃酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸；14批樣品的相似度為0.889～0.990。經(jīng)主成分分析，2個(gè)主成分因子的累積方差貢獻(xiàn)率為94.4%，樣品中8、9、11、12、14號(hào)共有峰（特別是8、9號(hào)共有峰）對(duì)應(yīng)成分的含量變化是導(dǎo)致樣品質(zhì)量差異的重要原因。結(jié)論：所建指紋圖譜及主成分分析結(jié)果可為小金膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

關(guān)鍵詞 小金膠囊；高效液相色譜法；指紋圖譜；主成分分析

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Xiaojin capsules， and to conduct principal component analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent TC-C18（2） column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% formic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 240 nm， and column temperature was 25 ℃. The sample size was 20 μL. Acetyl-11-keto-β-boswellic acid was used as reference and HPLC fingerprints of 15 batches of Xiaojin capsules were determined. The similarity evaluation of common peaks was conducted by using the TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2004A edition） to confirm common peaks. Principal component analysis was conducted by using Minitab 17.0 software. RESULTS： The similarity of 1 batch of sample was lower than 0.800； there was no common peaks No. 13， 14， 15 in HPLC chromatogram of the batch， compared with other 14 batches. There were 15 common peaks in the HPLC fingerprints of 14 batches of samples and three chromatographic peaks were identified， such as quercetin，amentoflavone， acetyl-11-keto-β-boswellic acid. The similarity of 14 batches ranged 0.889-0.990. Through principal component analysis， accumulative contribution rate of 2 principal component factors was 94.4%. It was indicated that the content change of corresponding components of common peaks No. 8， 9， 11， 12， 14 in samples was an important reason for the quality difference of samples， especially common peaks No.8， 9. CONCLUSIONS： The established HPLC fingerprint and principal component analysis can provide reference for quality evaluation of Xiaojin capsules.

KEYWORDS Xiaojin capsules； HPLC； Fingerprint； Principal component analysis

小金膠囊處方源于中醫(yī)經(jīng)典名方“小金丹”[1]，主要由人工麝香、木鱉子、制草烏、楓香脂、乳香、沒藥、當(dāng)歸、五靈脂、地龍、香墨等10味中藥材組成，具有散結(jié)消腫、化瘀止痛之功效，用于陰疽初起、皮色不變、腫硬作痛、多發(fā)性膿腫、癭瘤、瘰疬、乳巖、乳癖等[2]。其作為疽證研究的代表方，臨床上定位為疽證相關(guān)疾病的初期或是癰疽類疾病的慢性期，可用于治療甲狀腺結(jié)節(jié)、淋巴結(jié)核、子宮肌瘤、乳腺增生、乳腺癌、前列腺增生等癥[3-4]。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)，這些特點(diǎn)決定了難以用其中單個(gè)或幾個(gè)成分來準(zhǔn)確、全面地表達(dá)中藥的質(zhì)量和療效，需對(duì)中藥質(zhì)量進(jìn)行全面控制和多種藥效成分的綜合評(píng)價(jià)[5-6]。2015年版《中國藥典》（一部）對(duì)小金膠囊的質(zhì)量控制僅規(guī)定了鑒別、雜質(zhì)質(zhì)量和麝香酮的含量測定[2]，但其作為復(fù)方制劑，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在較大局限性，難以全面地評(píng)價(jià)其質(zhì)量。指紋圖譜技術(shù)是整體表征中藥所含成分及其質(zhì)量的一種有效方法，是目前中藥及中藥制劑質(zhì)量控制的有效手段之一[7-8]。因此，本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立了小金膠囊的指紋圖譜，并結(jié)合主成分分析進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，旨在為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2040C CN型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器、Labsolutions工作站（日本Shimadzu公司）；PGJ-10/20-AS型超純水儀（武漢品冠儀器設(shè)備有限公司）；UA800-DH型超聲波清洗儀（上海歐河機(jī)械設(shè)備有限公司）；ME203E型千分之一電子天平、ME104E型萬分之一電子天平、CP225D型十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

穗花杉雙黃酮對(duì)照品（批號(hào)：111902-201603，純度：97.7%）、11-羰基-β-乙酰乳香酸對(duì)照品（批號(hào)：111760- 201502，純度：99.3%）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081- 201610，純度：99.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；小金膠囊（健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：160601、170101、170102、 170107、170117、170121、170123、170124、170329、170334、170336、170544、170554、170868、171126，編號(hào)：S1～S15，規(guī)格：0.35 g/粒）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取穗花杉雙黃酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸、槲皮素對(duì)照品適量，分別加甲醇制成穗花杉雙黃酮50 μg/mL、11-羰基-β-乙酰乳香酸50 μg/mL、槲皮素50 μg/mL的單一對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取小金膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，精密稱定2 g，置于具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，水溫25 ℃以下超聲（功率：300 W，頻率：40 Hz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：170101）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，15個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.15%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均小于1.70%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：170101）適量，分別于室溫下放置0、2.5、5、7.5、10、12.5、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，15個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.50%（n=7），相對(duì)峰面積的RSD均小于1.60%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取小金膠囊（批號(hào)：170101）內(nèi)容物適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，15個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.19%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均小于2.50%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度評(píng)價(jià)、共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取15批小金膠囊內(nèi)容物適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對(duì)15批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版），以樣品的HPLC對(duì)照指紋圖譜為參照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，15批樣品中有14批樣品相似度大于0.880，其中13批樣品的相似度大于0.900；僅有1批樣品（批號(hào)：160601）相似度小于0.800，表明該批樣品與其他樣品間存在質(zhì)量差異，詳見表2。

2.4.3 共有峰的指認(rèn) 分別取“2.2.1”項(xiàng)下穗花杉雙黃酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸、槲皮素單一對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并與樣品的HPLC對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比指認(rèn)。結(jié)果，共有峰中4、6、12號(hào)色譜峰分別指認(rèn)為槲皮素、穗花杉雙黃酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸，詳見圖3。

2.4.4 共有峰的相關(guān)分析 14批樣品共有15個(gè)共有峰，其峰面積總和占色譜峰總面積的85.7%，詳見表3[因S1批樣品與其他樣品比較，缺13、14、15號(hào)共有峰，可能存在質(zhì)量異常，故該批樣品未進(jìn)行后續(xù)相關(guān)分析，僅對(duì)其余14批（S2～S15）樣品進(jìn)行相關(guān)分析]。通過與對(duì)照品的HPLC圖對(duì)比指認(rèn)，12號(hào)峰11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的峰面積較大、分離度較好，在HPLC圖譜中較穩(wěn)定，故以其保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算其他峰相對(duì)于12號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），詳見表4、表5。

2.5 主成分分析

以15個(gè)共有峰的峰面積為變量（x），將14批樣品15個(gè)共有峰數(shù)據(jù)（14×15）導(dǎo)入Minitab 17.0軟件進(jìn)行多變量主成分分析[9]，詳見表6。由表6可知，2個(gè)主成分因子的累積方差貢獻(xiàn)率為94.4%，提示2個(gè)主成分因子可作為評(píng)價(jià)樣品質(zhì)量的主要因子。由主成分因子與變量間的系數(shù)關(guān)系（見表7）分別得2個(gè)主成分因子的線性方程：主成分1=-0.009x1+0.003x2+0.018x3+0.036x4+0.001x5+0.003x6+0.017x7+0.591x8+0.696x9+0.056x10+0.128x11+0.263x12+0.073x13+0.257x14+0.068x15；主成分2=-0.009x1-0.042x2-0.142x3-0.146x4+0.025x5-0.012x6-0.042x7-0.736x8+0.550x9+0.053x10-0.203x11+0.234x12-0.041x13+0.089x14+0.034x15（式中x1、x2……x15表示各共有峰的峰面積）。

主成分因子1中，x9、x8的變量系數(shù)絕對(duì)值較大，其次為x12、x14；主成分因子2中，x8、x9的變量系數(shù)絕對(duì)值較大，其次為x12、x11。2個(gè)主成分因子與15個(gè)共有峰峰面積的載荷圖見圖4。由圖4可知，x9、x8、x12、x14、x11這5個(gè)共有峰峰面積的變化可反映樣品共有峰的整體變化（特別是8號(hào)和9號(hào)共有峰），表明樣品中8、9、11、12、14號(hào)共有峰對(duì)應(yīng)成分的含量變化是導(dǎo)致樣品質(zhì)量差異的重要因素（特別是8號(hào)和9號(hào)成分）。

3 討論

本研究建立了15批小金膠囊的HPLC指紋圖譜，14批樣品共有15個(gè)共有峰（因S1批樣品存在較大質(zhì)量差異，故不納入相關(guān)分析），并指認(rèn)了其中3個(gè)成分，分別為槲皮素、穗花杉雙黃酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸。

筆者在前期試驗(yàn)中分別考察了乙醇、甲醇、60%甲醇、甲醇-乙酸乙酯（1 ∶ 1，V/V）、甲醇-乙酸乙酯-三氯甲烷（3 ∶ 3 ∶ 4，V/V/V）為提取溶劑時(shí)的提取效果。結(jié)果，以甲醇為提取溶劑時(shí)，提取率高，提取成分多，且易于濾過，故選擇甲醇為提取溶劑。通過比較超聲提取、加熱回流提取的提取效果，發(fā)現(xiàn)超聲提取與回流提取效果相當(dāng)，但因超聲提取操作簡單、方便，故選擇超聲提取。

此外，筆者對(duì)甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸溶液不同流動(dòng)相，220、240、250、270、300 nm不同檢測波長時(shí)的色譜峰進(jìn)行比較。結(jié)果，以檢測波長為240 nm、乙腈-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，色譜峰峰形較好，無明顯拖尾現(xiàn)象，基線相對(duì)平穩(wěn)、噪音低。故選擇檢測波長為240 nm、流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液梯度洗脫。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜及主成分分析可為小金膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

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（收稿日期：2018-09-06 修回日期：2018-11-21）

（編輯：陳 宏）