滋膵飲對2型糖尿病模型大鼠的降糖作用及機制研究

劉欣欣 白茹 牛雯穎 王呈祥

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）21-2968-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.21.18

摘 要 目的：研究滋膵飲對2型糖尿病模型大鼠的降糖作用及其機制，為其臨床應用提供理論基礎。方法：將80只雄性大鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，單次腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg/kg復制2型糖尿病大鼠模型，另取10只大鼠作為正常組。將糖尿病模型大鼠隨機分為二甲雙胍組（陽性對照，0.2 g/kg）、模型組（等體積蒸餾水）和滋膵飲高、中、低劑量組（14.0、7.0、3.5 g/kg），每組10只。連續(xù)灌胃給藥2周后，采用全自動血糖儀測定各組大鼠空腹血糖值;采用酶聯(lián)免疫吸附法測定各組大鼠血清胰島素水平;采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測各組大鼠胰腺組織中c-Jun氨基末端激酶（JNK）、蛋白激酶B（Akt）和胰島素受體底物1（IRS-1）mRNA表達水平;Western blot法檢測各組大鼠胰腺組織中JNK、Akt、IRS-1蛋白的磷酸化程度。結果：與正常組比較，模型組大鼠空腹血糖、胰腺組織中JNK mRNA的表達水平和JNK、IRS-1蛋白的磷酸化程度均顯著升高（P<0.05或P<0.01），血清胰島素含量、Akt mRNA、IRS-1 mRNA的表達水平和Akt蛋白的磷酸化程度均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，二甲雙胍組和滋膵飲高、中劑量組大鼠空腹血糖均顯著降低（P<0.05），二甲雙胍組和滋膵飲高劑量組大鼠血清胰島素含量均顯著升高（P<0.01），二甲雙胍組和滋膵飲各劑量組大鼠胰腺組織中JNK mRNA的表達水平均顯著降低（P<0.01）、Akt mRNA、IRS-1 mRNA的表達水平均顯著升高（P<0.01）;二甲雙胍組和滋膵飲高劑量組大鼠的JNK、IRS-1蛋白的磷酸化程度均顯著降低（P<0.01）、Akt蛋白的磷酸化程度均顯著升高（P<0.01）。結論：滋膵飲具有明顯的降糖作用，其作用機制與降低胰島組織中JNK和IRS-1蛋白磷酸化程度和升高Akt蛋白磷酸化程度有關。

關鍵詞 滋膵飲;2型糖尿病;大鼠;胰島素;c-Jun氨基末端激酶;蛋白激酶B;胰島素受體底物1;血糖;作用機制

Study on Hypoglycemic Effect and Mechanism of Zicui Yin on Type Ⅱ Diabetic Rats

LIU Xinxin1，2，BAI Ru2，NIU Wenying2，WANG Chengxiang1（1.School of Basic Medicine， Guangxi University of TCM， Nanning 530000， China;2.College of Graduate， Heilongjiang University of TCM， Harbin 150040， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the hypoglycemic effect and mechanism of Zicui yin on type Ⅱ diabetic rats， and to provide theoretic basis for clinical application. METHODS： Eighty male rats were fed with high fat/sugar diet for 4 weeks， and then given intraperitoneal injected with streptozotocin （35 mg/kg） to induce type 2 diabetic model. Other 10 rats were included in normal group. Model rats were randomly divided into metformin group （positive control， 0.2 g/kg）， model group （constant volume of distilled water）， Zicui yin high-dose， medium-dose， low-dose groups （14.0， 7.0， 3.5 g/kg）， with 10 rats in each group. After 2 weeks of continuous intragastic administration， the fasting blood glucose of rats in each group was measured by automatic blood glucose meter. The serum insulin level was determined by ELISA. mRNA expression of JNK， Akt and IRS-1 were detected by RT-PCR; The phosphorylation of JNK， Akt and IRS-1 proteins in the pancreatic tissue of rats in each group was detected by Western blot method. RESULTS： Compared with normal group， the fasting blood glucose， mRNA expression of JNK， The phosphorylation of JNK and IRS-1 proteins in the pancreatic tissue of the model group were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， while the serum insulin content， mRNA expression of Akt and IRS-1， the phosphorylation of Akt protein were significantly decreased （P<0.01）. Compared with model group， the fasting blood glucose of rats in metformin group and Zicui yin high-dose and middle-dose groups decreased significantly （P<0.05）， the serum insulin content of rats in both metformin group and Zicui yin high-dose group increased significantly （P<0.01）， and mRNA expression of JNK in pancreatic tissue of rats in metformin group and Zicui yin groups decreased significantly （P<0.01）， while mRNA expression of Akt and IRS-1 increased significantly （P<0.01）. The phosphorylation of JNK and IRS-1 proteins in metformin group and Zicui yin high-dose group decreased significantly （P<0.01）， while the phosphorylation of ? ? ? ?Akt protein were increased significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： Zicui yin can significantly reduce blood glucose level， the mechanism of which may be related to decreasing the phosphorylation of JNK and IRS-1 proteins and increasing the phosphorylation of Akt proteins in pancreatic islets.

KEYWORDS ? Zicui yin; Type Ⅱ diabetes; Rat; Insulin; JNK; Akt; IRS-1; Blood glucose; Mechanism

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，以葡萄糖和脂肪代謝紊亂、血漿葡萄糖水平升高為基本特征[1]。糖尿病病理生理基礎為胰島素分泌不足以及胰島素的敏感性下降和胰高血糖素活性升高[2]。據(jù)2017年世界糖尿病聯(lián)盟報道，與2017年相比，預計到2045年，全球糖尿病患者將增長35%左右[3]。2型糖尿病的發(fā)病機制尚不明確，多認為是由胰島素抵抗和胰島B細胞功能障礙引起[4]。胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的重要機制之一，是胰島素無法有效地調(diào)節(jié)組織和細胞攝取及利用葡萄糖的一種代謝狀態(tài)[5]。

c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是哺乳類動物細胞中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的一個亞類，具有干擾胰島素的作用，能被炎性細胞因子和游離脂肪酸激活[6-8]。JNK基因在胰島細胞內(nèi)的表達會增加胰島細胞的凋亡，阻礙胰島素合成信號，抑制胰島素的生成，導致機體出現(xiàn)胰島素抵抗，從而影響機體對葡萄糖的吸收和利用。JNK信號通路處于激活狀態(tài)時，能夠降低胰島素受體底物1（IRS-1）上酪氨酸激酶的活性，抑制IRS-1的磷酸化，從而抑制IRS-1上的酪氨酸殘基與蛋白激酶B（Akt）上的亞基結合、抑制Akt的激活，最終導致胰島素信號轉導受阻，抑制胰島素和葡萄糖激酶的基因轉錄和合成[9-11]。因此，抑制JNK的激活對胰島細胞功能障礙有保護作用[12]。

雙胍類降糖藥是臨床上最為常用的降糖藥物，其長期應用所導致的抗藥性及副作用限制了其應用[13]。傳統(tǒng)的中藥復方制劑，具有不良反應較少的特點，在治療糖尿病方面，具有一定的效果[14]。滋膵飲方（由生黃芪、生地、生山藥、山茱萸、生豬胰腺組成）源自張錫純的《醫(yī)學衷中參西錄》[15]?，F(xiàn)代研究表明，滋膵飲方加地骨皮、天花粉、葛根、黃精、川連加味方藥對2型糖尿病、無自覺癥狀2型糖尿病等均有一定的治療作用 [16-17]。相關藥理研究發(fā)現(xiàn)，滋膵飲方能夠修復糖尿病模型大鼠損傷的胰島組織[18]?；诖?，本研究通過建立2型糖尿病模型大鼠，研究滋膵飲對其血糖的干預作用及其作用機制，為滋膵飲臨床防治糖尿病提供理論基礎和科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

UV-160PC紫外分光光度計（日本Shimadzu公司）;NANO 2000紫外分光光度計（美國Thermo公司）;ACCU-CHEK羅氏卓越血糖儀、卓越金銳血糖試紙（德國羅氏診斷有限公司）;H-2050R超速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）;Exicycler 96熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（韓國Bioneer公司）;WD-9413B凝膠成像系統(tǒng)（北京六一儀器廠）;ELX-800酶標儀（美國Biotek公司）。

1.2 藥品與試劑

生黃芪、生地、生山藥、山茱萸購自于黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學肖洪彬教授鑒定為真品;生豬胰腺購自于哈爾濱市中盛生豬定點屠宰場;鹽酸二甲雙胍片（澳大利亞艾華大藥廠，批號：8066462，規(guī)格：0.5 g）;胰島素試劑盒（北京誠林生物科技有限公司，批號：201810）;RNase酶抑制劑（批號：RP5602）、總RNA提取試劑盒（批號：RP1001）、Super M-MLV逆轉錄酶試劑盒（批號：PR6502）均購自北京百泰克生物技術有限公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）制備試劑盒（批號：WLA013）、蛋白提取試劑盒（批號：WLA019）、BCA蛋白定量試劑盒（批號：WLA004）、高敏化學發(fā)光試劑盒（批號：WLA003）、JNK一抗（批號：WL01295）、磷酸化JNK（p-JNK）一抗（批號：WL01813）、Akt一抗（批號：WL0003b）、磷酸化Akt（p-Akt）一抗（批號：WLp001a）、IRS-1一抗（批號：WL03123）、山羊抗兔二抗（批號：WLA023）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號：WL01845）均購自沈陽萬類生物科技有限公司;磷酸化IRS-1（p-IRS-1）一抗（美國CST科技有限公司，批號：2385s）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠90只，體質(zhì)量200～220 g，購于哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（黑）2016-001。實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為20～22 ℃，相對濕度為50%～65%。本研究經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準，所有研究均符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則。

2 方法與結果

2.1 滋膵飲的制備

將生黃芪15 g，生地50 g，生山藥50 g，山茱萸15 g四味藥材加入到10倍量的水中浸泡0.5 h后，煎煮2次，合并水煎液，藥液濃縮至質(zhì)量濃度為0.7 g /mL，于4 ℃保存?zhèn)溆?。取豬胰腺15 g剔除筋膜組織后，液氮速凍后，粉碎成細粉，臨用時每1 mL藥液中加入0.07 g，混勻，備用。

2.2 2型糖尿病模型大鼠的制備

取90只大鼠，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機抽取10只作為正常組，每籠5只，給予基礎飼料喂養(yǎng)，自由飲水。其余大鼠給予高糖高脂飼料（67%大鼠維持飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+0.5%膽酸鈉），每籠5只，自由飲水。喂養(yǎng)4周后，除正常組大鼠外，其余大鼠禁食不禁水12 h，單次腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液（STZ）35 mg/kg[19]造模。分別于注射STZ 3、7 d后，禁食不禁水過夜（約8 h），尾尖取血測定空腹血糖值。當2次空腹血糖值均大于>11.1 ?mmol/L時，表明造模成功。最后本實驗共取50只符合要求的模型大鼠。

2.3 動物分組與給藥

將造模成功的50只大鼠，按血糖值和體質(zhì)量隨機分為5組，滋膵飲高、中、低劑量（14.0、7.0、3.5 g/kg，根據(jù)臨床用量的4、2、1倍換算而得）組、二甲雙胍（陽性對照，0.2 g/kg根據(jù)臨床用量換算而得）組和模型組，每組10只。模型組和正常組大鼠給予等體積蒸餾水，灌胃體積均為20 mL/kg，每天給藥1次，連續(xù)灌胃給藥2周。

2.4 各組大鼠體質(zhì)量的測定

用電子秤測定各組大鼠在給藥前和給藥1周、2周后體質(zhì)量變化情況。

2.5 各組大鼠血糖的測定

末次給藥后，各組大鼠禁食不禁水過夜（約8 h），尾尖取血，并用血糖儀測定各組大鼠空腹血糖值。

2.6 各組大鼠血清胰島素含量的測定

給藥結束后大鼠禁食8 h，腹腔注射10%水合氯醛4 mL/kg麻醉，腹主動脈取血，分別于肝素鈉抗凝管中收集，在4 ℃下 2 500 r/min離心15 min，取上層血清入1.5 mL離心管中，-80 ℃冰箱保存，待用。將凍存的血清解凍后，用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測各組大鼠血清胰島素含量。

2.7 各組大鼠胰腺組織中JNK、Akt、IRS-1 mRNA的測定

每組取6只大鼠的胰腺組織，質(zhì)量均為100 mg，分別放入玻璃勻漿器中，按照總RNA提取試劑盒的試驗方法，提取各組大鼠胰腺組織的總RNA。然后將提取的總RNA進行反轉錄反應，得到其對應的cDNA，再以cDNA為模板，進行擴增，具體試驗操作流程依據(jù)相關試劑盒操作說明。PCR反應條件：95 ℃ 1 min;95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。按照2-ΔΔct相對定量法分析目的基因與內(nèi)參基因的相對表達水平。引物序列見表1。

2.8 Western blot法檢測各組大鼠胰腺組織中JNK、Akt、IRS-1蛋白及其磷酸化蛋白的表達水平

每組取3只大鼠的胰腺組織，質(zhì)量均為150 mg，分別加入1 mL裂解液，在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿后，冰浴下靜置30 min，使其完全裂解，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，提取上清液，并用BCA法測定蛋白濃度。SDS- PAGE凝膠電泳分離目的蛋白JNK、Akt、IRS-1，將電泳分離后的蛋白轉移到NC膜上，用5%的封閉奶粉室溫封閉30 min后，分別放入到JNK、Akt、IRS-1、p-JNK、p-Akt、p-IRS-1的一抗稀釋液 （1 ∶ 500）中，4 ℃孵育過夜。 次日，TBST洗膜3次，每次5 min。二抗稀釋液（1 ∶ 500）室溫孵育2 h后，TBST清洗3次，每次5 min。將NC膜放置于化學發(fā)光樣板上，均勻覆蓋500 μL發(fā)光試劑，放于凝膠成像儀中避光反應3 min，開始曝光成像。用凝膠成像系統(tǒng)進行灰度分析，β-actin蛋白為內(nèi)參蛋白。蛋白磷酸化程度以磷酸化蛋白條帶灰度值與非磷酸化蛋白條帶灰度值的比值表示 [20-21]。

2.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用單因素方差分析進行多組間比較;采用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較;以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量的測定結果

給藥前，與正常組比較，模型組和各給藥組大鼠的體質(zhì)量均顯著降低（P<0.01）;給藥后，與模型組比較，滋膵飲高劑量組大鼠體質(zhì)量增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠體質(zhì)量的測定結果見表2。

3.2 各組大鼠血糖的測定結果

給藥前，與正常組比較，其余各組大鼠空腹血糖均顯著升高（P<0.01）。給藥后，與模型組比較，二甲雙胍組及滋膵飲高、中劑量組大鼠空腹血糖均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠血糖測定結果見表3。

3.3 各組大鼠血清胰島素含量測定結果

與正常組比較，模型組大鼠血清胰島素含量顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，二甲雙胍組和滋膵飲高劑量組大鼠血清胰島素含量均顯著升高（P<0.01）。各組大鼠血清胰島素含量測定結果見表4。

3.4 各組大鼠胰腺組織中JNK、Akt、IRS-1 mRNA的測定結果

與正常組比較，模型組大鼠胰腺組織中JNK mRNA 的表達水平顯著升高（P<0.01），Akt、IRS-1 mRNA的表達水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠胰腺組織中JNK mRNA 的表達水平均顯著降低（P<0.01），Akt、IRS-1 mRNA的表達水平均顯著升高（P<0.01）。各組大鼠胰腺組織中JNK、Akt、IRS-1 mRNA的測定結果見表5。

3.5 各組大鼠胰腺組織中JNK、Akt、IRS-1蛋白及其磷酸化測定結果

與正常組比較，模型組大鼠胰腺組織中JNK、IRS-1蛋白的磷酸化程度顯著升高（P<0.01），而Akt蛋白的磷酸化程度顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，滋膵飲高劑量組及二甲雙胍組大鼠胰腺組織中JNK和IRS-1蛋白的磷酸化程度顯著降低（P<0.05或P<0.01），而Akt蛋白的磷酸化程度顯著升高（P<0.01）。各組大鼠胰腺組織中JNK、Akt、IRS-1蛋白及其磷酸化蛋白表達的電泳圖見圖1，各組大鼠胰腺組織中JNK、Akt、IRS-1蛋白及其磷酸化蛋白的測定結果見表6。

4 討論

糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”范疇，多由飲食失節(jié)、情志失調(diào)、勞累過度等因素所致，其主要病機為陰津虧損、燥熱偏勝，臨床表現(xiàn)為多食、多飲、多尿、消瘦、乏力的癥狀[1]。滋膵飲方由生黃芪、生地、生山藥、山茱萸、生豬胰腺組成，方中重用黃芪助脾運以升清，助腎之氣化與封藏以固攝精微;生地滋陰，助腎中之陰上潮以潤肺;山藥健脾益氣，使脾氣旺而陰自升，與生地合用共奏養(yǎng)陰生津之功;山茱萸封固腎關，益腎收斂，以助生地山藥斂陰生津;豬胰臟以臟補臟，為血肉有情之品，重補脾胰且能潤肺升水以止渴，諸藥合用共奏益氣養(yǎng)陰、清熱生津之功[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清胰島素含量低于正常組，滋膵飲干預后，大鼠血清胰島素的含量高于模型組，說明滋膵飲能夠刺激胰島細胞分泌胰島素。模型組大鼠JNK mRNA的表達水平高于正常組，Akt、IRS-1 mRNA的表達水平低于正常組，滋膵飲干預后，JNK mRNA 的表達低于模型組，提示滋膵飲能夠抑制JNK mRNA的表達。IRS是胰島素信號轉導途徑中的重要的上游分子，其表達水平的下降可使胰島素信號轉導減弱，從而導致胰島素的效能降低[23]。本實驗結果表明，與模型組大鼠比較，滋膵飲干預后大鼠Akt、IRS-1 mRNA的相對表達量均高于模型組大鼠，提示滋膵飲能夠上調(diào)大鼠Akt、IRS-1 mRNA的表達水平從而增強胰島素信號的轉導，提升胰島素的效能。與模型組比較，滋膵飲干預后，JNK、IRS-1蛋白的磷酸化程度低于模型組;Akt蛋白的磷酸化程度高于模型組，提示滋膵飲能夠阻礙JNK信號的激活，上調(diào)IRS-1 mRNA表達，降低IRS-1蛋白的表達，從而促進胰島素與其受體結合，提高IRS-1 mRNA表達和IRS-1磷酸化進程，增強Akt的活化，增強胰島素分泌水平，從而達到了降血糖的目的。

綜上所述，滋膵飲能夠降低2型糖尿病大鼠的血糖水平，其機制可能與抑制JNK信號通路的激活，降低JNK、IRS-1蛋白磷酸化程度和上調(diào)Akt蛋白磷酸化程度有關。

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（收稿日期：2019-05-26 修回日期：2019-08-01）

（編輯：唐曉蓮）