廣東省番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定及序列分析

湯亞飛 佘小漫 李正剛 于琳 藍(lán)國(guó)兵 鄧銘光 何自福

摘要 番茄黃化曲葉病毒病是世界番茄生產(chǎn)上一種毀滅性病害，番茄黃化曲葉病毒Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）是引起該病害的主要病原病毒之一。本文采用滾環(huán)擴(kuò)增及基因克隆方法，獲得了侵染廣東佛山和肇慶番茄的TYLCV 4個(gè)分離物全基因組;它們均為2 781 nt，編碼6個(gè)ORF，其中病毒鏈上編碼AV1和AV2，互補(bǔ)鏈上編碼AC1、AC2、AC3和AC4。同源性比較結(jié)果表明，4個(gè)廣東分離物基因組序列兩兩間同源性為99%以上;與已報(bào)道的TYLCV各分離物同源性在90%以上，而與來(lái)自中國(guó)不同地區(qū)的TYLCV分離物的同源率均在98%以上。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，廣東分離物與來(lái)自中國(guó)不同地區(qū)的TYLCV分離物親緣關(guān)系較近，并聚類在一個(gè)分支。因此，侵染引起廣東佛山和肇慶番茄黃化曲葉病的病毒應(yīng)來(lái)自國(guó)內(nèi)其他地區(qū)。本研究是對(duì)TYLCV廣東分離物分子特征的首次報(bào)道。

關(guān)鍵詞 番茄黃化曲葉病毒; 分子鑒定; 序列分析

中圖分類號(hào)： S 432.41

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018333

番茄黃化曲葉病是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響番茄生產(chǎn)的一種重要病害，已給熱帶和亞熱帶地區(qū)的番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[1]。在我國(guó)，蔡健和等1994年首次在廣西報(bào)道了該病害的發(fā)生[2]。2006年以來(lái)，番茄黃化曲葉病在全國(guó)范圍大面積暴發(fā)和流行。在廣東，何自福等2003年率先報(bào)道番茄黃化曲葉病危害番茄[3]，到目前為止，廣東省幾乎所有番茄產(chǎn)區(qū)均有該病害的發(fā)生。番茄植株感染該病害后主要表現(xiàn)為植株矮化，葉緣黃化，葉片皺縮、卷曲。早期感病時(shí)，植株無(wú)法正常開花結(jié)果;后期感病，植株上部新葉表現(xiàn)癥狀，結(jié)果量減少，果實(shí)變小[4]。

番茄黃化曲葉病是由煙粉虱傳雙生病毒侵染所導(dǎo)致的。全世界已報(bào)道可侵染番茄的雙生病毒至少有88種[5]，在我國(guó)，已報(bào)道的引起番茄黃化曲葉病的雙生病毒至少有16種[616]，其中TYLCV分布最廣，是引起全球各地番茄黃化曲葉病的主要病原之一。該病毒最先在以色列發(fā)現(xiàn)，之后隨著傳播介體煙粉虱在全球范圍暴發(fā)而蔓延至中東、地中海沿岸、非洲、美洲、澳洲和亞洲等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)[17]。在我國(guó)，Wu等2006年首次在上海番茄上發(fā)現(xiàn)TYLCV[6]，之后在北京[18]、河北[19]、吉林[20]、陜西[21]、天津[22]、河南[23]、浙江[24]、江蘇[25]、新疆[26]、山東[27]、安徽[28]、福建[29]、湖北[4]、湖南[30]、云南[31]、山西[32]、遼寧[33]、寧夏[34]、甘肅[35]等20個(gè)省市番茄產(chǎn)區(qū)均有檢測(cè)到該病毒，并造成嚴(yán)重?fù)p失的報(bào)道。在廣東，2004年即有番茄黃化曲葉病的發(fā)生，但直到2011年9月才在佛山市三水區(qū)的番茄產(chǎn)區(qū)檢測(cè)到TYLCV。本文對(duì)危害廣東番茄的TYLCV全基因組進(jìn)行了克隆及序列分析，明確了TYLCV廣東分離物的分子特征，為該病毒病監(jiān)測(cè)與防控提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

罹患番茄黃化曲葉病的番茄葉片樣品采自廣東省佛山市三水區(qū)、肇慶市高要市等番茄產(chǎn)區(qū);以TYLCV侵染性克隆注射接種發(fā)病的番茄植株葉片作為陽(yáng)性對(duì)照，以健康番茄植株葉片作為陰性對(duì)照。

1.2 供試番茄樣品總DNA提取

取番茄病葉組織100 mg，用北京全式金生物技術(shù)有限公司的植物DNA提取試劑盒（Easy Pure Plant Genomic DNA Kit）抽提其總DNA。具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。DNA沉淀溶解于50 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L EDTA， pH8.0）溶液中。

1.3 PCR 檢測(cè)

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒通用簡(jiǎn)并引物AV494/CoPR[3637]，對(duì)疑似病樣進(jìn)行PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為：番茄病樣總DNA 1 μL（約20 ng），滅菌水 9.5 μL，PCR Mixer 12.5 μL（TaKaRa公司），10 μmol/L上、下游引物各 1 μL，總體積為 25 μL。反應(yīng)程序：94℃ 4 min;94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 全基因組序列的擴(kuò)增

取PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的病樣總DNA，分別取1.0 μL（約20 ng）為模板，利用TempliPhiTM RCA Kit （GE Healthcare）進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA），以獲得病毒的全基因組。具體方法按照試劑盒說(shuō)明書上的步驟進(jìn)行。RCA反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物分別用BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系為：RCA產(chǎn)物2 μL、內(nèi)切酶1 μL、10×內(nèi)切酶緩沖液1 μL，總酶切反應(yīng)體系為10 μL。在37℃條件下酶切2 h以上，然后進(jìn)行電泳分析。若酶切產(chǎn)物為2.5～3.0 kb，或同時(shí)還產(chǎn)生1.3 kb左右的條帶，則克隆這些特異性條帶。

1.5 基因克隆與序列分析

應(yīng)用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Thermo公司）回收RCA酶切產(chǎn)物，純化后連接到相應(yīng)酶切的pGEM-3Z載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，每個(gè)平板隨機(jī)挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。利用DNAStar軟件（DNASTAR Inc，Madison，USA）的SeqMan對(duì)所獲得的基因序列進(jìn)行拼接，利用BLAST程序進(jìn)行序列相似性搜索，進(jìn)一步用DNAStar的MegAlign進(jìn)行序列比較分析，ORF預(yù)測(cè)使用NCBI網(wǎng)站的ORF Finder，采用MEGA 5.05的鄰接法（neighbor joining，NJ），設(shè)置Bootstrapping值為1 000，構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒特異簡(jiǎn)并引物AV494和CoPR進(jìn)行PCR檢測(cè)，從采集的疑似番茄黃化曲葉病樣品的總DNA中均擴(kuò)增到1條與陽(yáng)性對(duì)照大小一致的特異片段，長(zhǎng)度為570 bp，而健康植株樣品總DNA中未擴(kuò)增出任何片段（圖1）。表明疑似病樣中均含有菜豆金色花葉病毒屬病毒。

2.2 病毒分離物基因組的克隆與序列分析

選取PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的病樣總DNA，分別進(jìn)行RCA和酶切反應(yīng)，RCA產(chǎn)物均能被BamHⅠ切出1條約2.7 kb大小的單一條帶，將2.7 kb大小的條帶進(jìn)行分子克隆和序列測(cè)定，結(jié)果表明，來(lái)自廣東番茄的SS11、SS12、SS13、GY01 4個(gè)分離物 （GenBank登錄號(hào)為：JQ867092、JX128099、KC810892、KF356163）全長(zhǎng)大小均為2 781 nt，且兩兩間序列同源率均為99.0%以上。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，侵染廣東番茄的4個(gè)菜豆金色花葉病毒屬病毒分離物基因組DNA-A結(jié)構(gòu)特征完全一致，為單鏈閉合環(huán)狀，編碼6個(gè)ORFs。基因組病毒鏈含AV1基因 （308-1 084 nt，編碼CP）和AV2基因 （148-498 nt，編碼與病毒移動(dòng)相關(guān)蛋白），互補(bǔ)鏈含有AC1基因（1 542-2 615 nt，編碼復(fù)制酶）、AC2基因（1 226-1 633 nt，轉(zhuǎn)錄激活蛋白）和AC3基因（1 081-1 485 nt，編碼復(fù)制增強(qiáng)蛋白）和AC4基因（2 171-2 464 nt，編碼復(fù)制或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子）。在AV2與AC1之間有1個(gè)313 nt的非編碼區(qū)（位于2 616-147 nt），其中含有與雙生病毒復(fù)制起始有關(guān)的保守序列TAATATTAC（位于2 775-2 nt）[38]。

BLAST結(jié)果顯示，與廣東分離物 DNA-A序列有較高相似性的序列均為TYLCV分離物。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)（圖2），廣東分離物與來(lái)自我國(guó)不同地區(qū)的TYLCV 13個(gè)分離物以及國(guó)外不同國(guó)家來(lái)源的TYLCV 19個(gè)分離物的相似性均為90%以上;其中與來(lái)自中國(guó)不同地區(qū)的TYLCV 13個(gè)分離物的相似性均在98%以上，而與阿曼Tom-48分離物（登錄號(hào)：KF229725）相似性最低，為90.2%。

2.3 親緣關(guān)系分析

為了分析TYLCV廣東分離物與已報(bào)道的各TYLCV分離物的親緣關(guān)系，將TYLCV廣東分離物及上述32個(gè)分離物構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以侵染廣東番茄的臺(tái)灣番茄曲葉病毒Tomato leaf curl Taiwan virus（ToLCTWV）白沙分離物（DQ237918）為外組。結(jié)果顯示（圖3），TYLCV 廣東分離物與來(lái)自中國(guó)不同地區(qū)的13個(gè)分離物及國(guó)外的11個(gè)分離物親緣關(guān)系較近，聚在一個(gè)分支，進(jìn)一步與科威特KISR分離物形成一個(gè)大的分支;與日本Mild[Tokai]分離物、西班牙Mild[Spain7297]分離物、留尼汪島分離物、日本Sz分離物4個(gè)分離物的親緣關(guān)系較近，而與阿巴代分離物、伊朗分離物及阿曼Tom-48分離物 3個(gè)分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

本研究采用RCA擴(kuò)增及基因克隆方法，獲得了侵染廣東佛山和肇慶番茄的雙生病毒4個(gè)廣東分離物基因組全序列，大小均為 2 781 nt，序列間相似性為99%;這些分離物與TYLCV 13個(gè)中國(guó)分離物及19個(gè)不同國(guó)家來(lái)源分離物的相似性均大于90%，且與TYLCV 13個(gè)中國(guó)分離物的相似性均在98%以上。根據(jù)目前國(guó)際雙生病毒分類方案[5]，侵染引起廣東佛山和肇慶番茄黃化曲葉病的病毒應(yīng)該屬于TYLCV分離物。

TYLCV最早發(fā)現(xiàn)于以色列，之后迅速擴(kuò)散，現(xiàn)已在全球范圍發(fā)生。國(guó)內(nèi)最早于2006年在上海番茄上檢測(cè)到，隨后成為我國(guó)番茄黃化曲葉病的主要病原病毒之一。2003年在廣東首次發(fā)現(xiàn)了番茄黃化曲葉病[3]。自從該病害發(fā)生以來(lái)，本團(tuán)隊(duì)一直對(duì)廣東省該病害的發(fā)生和病原病毒種類進(jìn)行鑒定和監(jiān)測(cè)，2011年以前，引起廣東省番茄黃化曲葉病的病毒種類為廣東番茄曲葉病毒Tomato leaf curl Guangdong virus（ToLCGdV）、廣東番茄黃化曲葉病毒Tomato yellow leaf curl Guangdong virus（TYLCGdV）和ToLCTWV 3種病毒[1113]。 2011年9月，首次在佛山市三水區(qū)的番茄產(chǎn)區(qū)上檢測(cè)到TYLCV，隨后2013年在肇慶市高要市蜆崗鎮(zhèn)番茄也檢測(cè)到該病毒?？梢姡琓YLCV也入侵廣東危害番茄，正在成為引起廣東番茄黃化曲葉病的病原病毒之一。 更進(jìn)一步的序列分析發(fā)現(xiàn)其與侵染中國(guó)其他地區(qū)番茄的TYLCV相似性高，親緣關(guān)系近。因此，推測(cè)侵染廣東番茄的TYLCV病毒是從國(guó)內(nèi)其他發(fā)生TYLCV的地區(qū)通過(guò)蔬菜、種苗運(yùn)輸以及煙粉虱的擴(kuò)散等途徑傳入、定殖。

本文首次對(duì)侵染廣東省番茄的TYLCV進(jìn)行分子鑒定和序列分析，明確TYLCV廣東分離物的分子特征，對(duì)開展TYLCV在我國(guó)的擴(kuò)散、序列變異與進(jìn)化等方面研究提供了基礎(chǔ)，同時(shí)也為廣東省番茄抗病新品種的選育及番茄黃化曲葉病的防控提供了科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）