基于TRPV1和P2X3交互作用的大鼠外周痛感覺調控機制

杜俊英，房軍帆，項璇兒，徐子童，方劍喬

(浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院， 浙江省針灸神經病學研究重點實驗室，杭州 310053)

背根神經節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)是感覺傳入的初級神經元，是感覺沖動從外周傳到中樞的第一站，具有傳輸、傳導機體感覺和傷害性感覺的功能[1]。大量的離子通道和受體在DRG中表達，如辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid type 1, TRPV1)和P2X嘌呤受體3(purinergic P2X3 receptor, P2X3)。TRPV1和P2X3均為重要的疼痛相關受體，高度表達于DRG的中小直徑神經元細胞中，參與不同類型疼痛的信號轉導過程。已有研究報道，TRPV1和P2X3在DRG水平有共表達[2]。在病理狀態(tài)下，動物模型和藥理實驗研究均發(fā)現(xiàn)，TRPV1和P2X3存在相關作用，且不同病理狀態(tài)的相互作用關系不同[3]。在生理狀態(tài)下，已有研究采用DRG神經元及轉染細胞HEK293，觀察到TRPV1和P2X3存在相互抑制作用[4-5]。但未在正常大鼠中觀察DRG水平TRPV1與P2X3的相關作用關系。本研究擬通過足底注射TRPV1激動劑和(或)P2X3激動劑/抑制劑、P2X3激動劑和(或)TRPV1激動劑/抑制劑，觀察其痛行為學、DRG水平TRPV1和P2X3陽性細胞面積、TRPV1和P2X3的共表達及相關關系，部分闡明基于TRPV1和P2X3交互作用的外周痛感覺調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

6周齡雄性清潔級SD大鼠72只，體重180～200 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供【SCXK(滬)2013-0016】，浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心【SYXK(浙)2013-0184】飼養(yǎng)及完成部分實驗內容。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料及自由飲水，控制溫度和濕度(23±2℃，60%)，12 h循環(huán)燈光。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》，所有操作均符合實驗動物倫理學要求(倫理審批號：ZSLL-2015-022)。

1.1.2 實驗試劑

Capsaicin(Sigma, 美國)，capsazepine(Sigma，美國)，αβ-methylene ATP(Sigma，美國)，TNP-ATP(Sigma，美國)，兔抗大鼠TRPV1(Abcam，美國)，豚鼠抗大鼠P2X3(Abcam，美國)，兔抗大鼠P2X3(Abcam，美國)，Alexa FluorR488標記驢抗兔二抗(Invetrogen，英國)，Alexa FluorR647標記驢抗豚鼠二抗(Invetrogen，英國)，GAPDH(SCT，美國)，瓊脂糖珠(Santa Cruz，美國)，ECL試劑盒(碧云天，中國)。

1.1.3 實驗儀器

熒光顯微鏡(Nikon，日本)，冰凍切片機(Thermo，美國)，抗熒光淬滅封片液(碧云天，中國)，全波長分光光度儀(Molecular Devices，美國)，電泳儀(Bio-Rad美國)，半干轉印儀(Bio-Rad，美國)，Image Quant LAS 4000凝膠成像系統(tǒng)(GE，美國)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

所有大鼠完全隨機分為空白對照組、TRPV1激動劑組、P2X3激動劑組、TRPV1激動劑+P2X3激動劑組、TPRV1激動劑+P2X3抑制劑組、P2X3激動劑+TRPV1抑制劑組6組，每組各12只。

1.2.2 藥物處理

①TRPV1激動劑組：足底皮下注射capsaicin100 μg，體積50 μL；②P2X3激動劑組：足底皮下注射αβ-methyline ATP600 nmol，體積50 μL；③TRPV1激動劑+P2X3激動劑組：足底皮下同時注射capsaicin 100 μg，αβ-methyline ATP600 nmol，體積50 μL；④TPRV1激動劑+P2X3抑制劑組：足底皮下同時注射capsaicin100 μg，TNP-ATP 300 nmol，體積50 μL。⑤P2X3激動劑+TRPV1抑制劑組：足底皮下同時注射αβ-methyline ATP600 nmol，capsazepine 200 μg，體積50 μL。

空白對照組：注射相同劑量的生理鹽水。

1.2.3 痛行為學觀察

實驗前，將大鼠置于鐵絲網上塑料盒內1 h以適應環(huán)境，持續(xù)適應5 d。實驗時，先將大鼠置于鐵絲網上塑料盒內30 min適應環(huán)境，在此過程中，采用胰島素注射針頭足底皮下注射相應藥物，觀察大鼠每2 min內的縮足次數(shù)、抬腿/舔足持續(xù)時間，持續(xù)觀察20 min。

1.2.4 免疫熒光方法觀察L4DRG水平TRPV1和P2X3陽性面積表達

觀察完行為學后，每組取5只大鼠戊巴比妥(40 mg/kg,bw)腹腔注射麻醉，經心主動脈生理鹽水(4℃預冷)灌注至大鼠肝變白，接著緩慢推注4%多聚甲醛150 mL?？焖偃〕鲎⑸鋫萀4 DRG，置4%多聚甲醛溶液中后固定3 h。然后分別置于15%、30%蔗糖溶液梯度脫水后，經液氮速凍后，置入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

行冰凍切片(厚度12 μm)，TBST清洗5 min×3次，5%正常驢血清37℃封閉1 h洗，兔抗大鼠TRPV1(ab63104)或P2X3(ab10269)一抗4℃孵育過夜(含5%正常驢血清TBST稀釋)，Alexa FluorR488標記驢抗兔二抗37℃孵育1 h(含5%正常驢血清TBST稀釋)，風干，抗熒光淬滅封片液封片。熒光顯微鏡拍攝L4DRG處TRPV1或P2X3表達。以上步驟均避光完成。Image Pro Plus 5.0軟件分析。

1.2.5 免疫熒光方法觀察L4 DRG水平TRPV1和P2X3共表達

除采用兔抗大鼠TRPV1(ab63104)和豚鼠抗大鼠P2X3(ab10267)一抗4℃孵育過夜，Alexa FluoR488標記驢抗兔二抗和Alexa FluorR647標記驢抗豚鼠二抗37℃孵育1 h外，其余方法1.2.4。

1.2.6 免疫共沉淀法觀察L4 DRG水平TRPV1和P2X3相互作用

觀察完行為學后，每組取7只大鼠戊巴比妥[40 mg/(kg·bw)]腹腔注射麻醉大鼠，用4℃生理鹽水快速灌注，直至流出液為澄清液體?？焖偃〕鲎⑸鋫萀4 DRG，入預冷的EP管中，置入-80℃冰箱中保存。取L4 DRG，加Western及IP細胞裂解液(碧云天)超聲粉碎，BCA蛋白定量，取200 μg蛋白混合液，加入1 μg兔抗大鼠TRPV1或1 μg兔抗大鼠P2X3，4℃緩慢搖動孵育過夜，加入平衡好的瓊脂糖珠4℃搖動孵育3 h，離心去上清，裂解液清洗后加2× 上樣緩沖液，95℃變性5 min，SDS-PAGE凝膠分離蛋白，半干轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入兔抗大鼠P2X3(ab10269)或兔抗大鼠TRPV1(ab63104)4℃孵育過夜；TBST搖洗3次后加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶10000, 美國 Santa Cruz Biotechnology公司)，室溫孵育2 h，TBST搖洗3次；ECL試劑盒顯色，Image Quant LAS4000系統(tǒng)拍照。采用非沉淀蛋白做對照。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 生理狀態(tài)下外周P2X3對TRPV1誘發(fā)的痛行為的影響

2.1.1 各組大鼠縮足、抬腿持續(xù)時間

我們觀察各組大鼠藥物注射后每2 min內的縮足、抬腿持續(xù)時間，共觀察了20 min，結果如圖1A、B所示。TRPV1激動劑組在觀察的20 min內，其縮足、抬腿持續(xù)時間均顯著多于正常對照組，其中在藥物注射后2 min時達最高值，之后縮足、抬腿持續(xù)時間緩慢下降。TRPV1激動劑+P2X3激動劑組大鼠于藥物注射后8 min，其縮足、抬腿持續(xù)時間與空白對照組比較無差異，而在藥物注射后14、18、20 min時，與空白對照組比較其縮足、抬腿持續(xù)時間增多。TRPV1激動劑+P2X3抑制劑組大鼠于藥物注射后6 min開始至整個實驗結束，其縮足、抬腿持續(xù)時間與空白對照組比較無差異。從各組大鼠縮足、抬腿總持續(xù)時間實驗觀察，結果發(fā)現(xiàn)，TRPV1激動劑組、TRPV1激動劑+P2X3激動劑組、TRPV1激動劑+P2X3抑制劑組均能有效增加正常大鼠縮足、抬腿總持續(xù)時間；其中TRPV1激動劑+P2X3抑制劑組縮足、抬腿總持續(xù)時間顯著少于TRPV1激動劑組。

2.1.2 各組大鼠縮足、抬腿次數(shù)

我們觀察各組大鼠藥物注射后每2 min內的縮足、抬腿次數(shù)，結果與縮足、抬腿次數(shù)相似，結果如圖1C、D所示。TRPV1激動劑組在觀察的20 min內，其縮足、抬腿次數(shù)均顯著多于正常對照組，其中在藥物注射后2 min時達最高值，之后縮足、抬腿次數(shù)緩慢下降。TRPV1激動劑+P2X3激動劑組大鼠于藥物注射后8 min縮足、抬腿次數(shù)降至最低值，與空白對照組比較無差異，而后又開始增多，于藥物注射后12、16、18、20 min時其縮足、抬腿次數(shù)明顯多于空白對照組。TRPV1激動劑+P2X3抑制劑組大鼠于藥物注射后6 min開始至整個實驗結束，其縮足、抬腿次數(shù)與空白對照組比較無差異。從各組大鼠縮足、抬腿總次數(shù)實驗觀察，結果發(fā)現(xiàn)，TRPV1激動劑組、TRPV1激動劑 + P2X3激動劑組、TRPV1激動劑 + P2X3抑制劑組均能有效增加正常大鼠縮足、抬腿總次數(shù)；其中TRPV1激動劑 + P2X3抑制劑組縮足、抬腿總次數(shù)顯著少于TRPV1激動劑組和TRPV1激動劑 + P2X3激動劑組。

2.2 生理狀態(tài)下外周TRPV1對P2X3誘發(fā)的痛行為的影響

2.2.1 各組大鼠縮足、抬腿持續(xù)時間

我們觀察各組大鼠藥物注射后每2 min內的縮足、抬腿持續(xù)時間，共觀察了20 min，結果如圖2A、B所示。P2X3激動劑組在藥物僅注射后8、10 min兩個時間點其縮足、抬腿持續(xù)時間明顯多于空白對照組。P2X3激動劑+TRPV1激動劑組在藥物注射后2 min時其縮足、抬腿持續(xù)時間達最高值，而后逐漸下降，于藥物注射后8 min降至最低，藥物注射后12 min以后每2 min，其縮足、抬腿持續(xù)時間多于空白對照組。P2X3激動劑 + TRPV1抑制劑組在造模后2、4、6 min，其縮足、抬腿持續(xù)時間顯著多于空白對照組，其他時間點與空白組比較無差異。從各組大鼠縮足、抬腿總持續(xù)時間實驗觀察，結果發(fā)現(xiàn)，P2X3激動劑組、P2X3激動劑 + TRPV1激動劑組、P2X3激動劑 + TRPV1抑制劑組均能有效增加正常大鼠縮足、抬腿總持續(xù)時間；其中P2X3激動劑 + TRPV1抑制劑組縮足、抬腿總持續(xù)時間顯著少于P2X3激動劑 + TRPV1激動劑組。

2.2.2 各組大鼠縮足、抬腿次數(shù)

我們觀察各組大鼠藥物注射后每2 min內的縮足、抬腿次數(shù)，共觀察了20 min，結果如圖2C、D所示。與空白對照組比較，P2X3激動劑組藥物注射后18 min內的每2 min其縮足、抬腿次數(shù)均增多；P2X3激動劑 + TRPV1抑制劑組于藥物注射后2 min其縮足、抬腿次數(shù)最多，其后逐漸減少，于藥物注射后8 min達最低值與空白對照組比較無差異，而后10、12、14、16、18、20 min其縮足、抬腿次數(shù)亦明顯多于空白對照組；P2X3激動劑 + TRPV1抑制劑組僅于藥物注射后2、4、6、8 min縮足、抬腿次數(shù)多于空白對照組。從各組大鼠縮足、抬腿總次數(shù)實驗觀察，結果發(fā)現(xiàn)，P2X3激動劑組、P2X3激動劑 + TRPV1激動劑組、P2X3激動劑 + TRPV1抑制劑組均能有效增加正常大鼠縮足、抬腿次數(shù)；其中P2X3激動劑 + TRPV1抑制劑組縮足、抬腿總持續(xù)時間顯著少于P2X3激動劑 + TRPV1激動劑組。

2.3 生理狀態(tài)下外周P2X3對TRPV1陽性面積表達的影響

我們采用免疫熒光單標法觀察各組大鼠L4DRG水平TRPV1陽性面積表達，結果如圖3所示。如圖3B所示，L4DRG水平TRPV1激動劑 + P2X3激動劑組TRPV1陽性細胞面積表達明顯多于空白對照組、TRPV1激動劑組和TRPV1激動劑+P2X3抑制劑組。

2.4 生理狀態(tài)下外周TRPV1對P2X3陽性面積表達的影響

注：a：空白對照組；b：TRPV1激動劑組；c：TRPV1激動劑+P2X3激動劑組；d：TPRV1激動劑+P2X3抑制劑組；e：P2X3激動劑組；f：P2X3激動劑+TRPV1激動劑組；g：P2X3激動劑+TRPV1抑制劑組。(下圖同)與空白對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與TRPV1激動劑組比較，#P< 0.05，##P< 0.01；與TRPV1激動劑+P2X3激動劑組比較，△P< 0.05，△△P< 0.01。圖1 外周P2X3對TRPV1誘發(fā)的痛行為影響Note. a,control group.b,TRPV1 agonist group.c,TRPV1 agonist + P2X3 agonist group.d,TRPV1 agonist +P2X3 inhibitor group.e,P2X3 agonist group.f,P2X3 agonist +TRPV1 agonist group.g,P2X3 agonist+TRPV1 inhibitor group.(The same in the following figures)Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the TRPV1 agonist group,# P < 0.05,## P < 0.01. Compared with the TRPV1 agonist + P2X3 agonist group,△P< 0.05,△△P< 0.01.Figure 1 Effect of peripheral P2X3 on TRPV1-induced pain behavior

注：與空白對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01； 與P2X3激動劑組比較,●P< 0.05，●●P< 0.01；與P2X3激動劑+TRPV1激動劑組比較，△P< 0.05，△△P< 0.01。圖2 外周TRPV1對P2X3誘發(fā)的痛行為影響Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the P2X3 agonist group,●P< 0.05,●●P< 0.01. Compared with the P2X3 agonist group + TRPV1 agonist,△P< 0.05,△△P< 0.01.Figure 2 Effect of peripheral TRPV1 on P2X3-induced pain behavior

我們采用免疫熒光單標法觀察各組大鼠L4DRG水平P2X3陽性細胞表達，結果如圖4所示。如圖4B所示，L4DRG水平，P2X3激動劑+TRPV1激動劑組P2X3陽性面積表達顯著多于空白對照組、P2X3激動劑組、P2X3激動劑+TRPV1抑制劑組。

2.5 生理狀態(tài)下外周TRPV1與P2X3的共變達及相互關系

我們采用熒光雙標法和免疫共沉淀法觀察L4DRG水平TRPV1和P2X3的相關關系。結果如圖5所示，熒光雙標法結果提示TRPV1和P2X3在DRG水平共表達于中小神經元細胞；免疫共沉淀結果提示TRPV1和P2X3之間有相關作用關系。

圖3 各組大鼠L4DRG水平TRPV1陽性面積表達情況Figure 3 Expression of TRPV1 positive area at L4 DRG levels of the rats in each group

圖4 各組大鼠L4DRG水平P2X3陽性面積表達情況Figure 4 Expression of P2X3 positive area at L4 DRG levels of rats in each group

注：A. P2X3和TRPV1免疫熒光單標及雙標圖。B. TRPV1和P2X3免疫共沉淀圖。圖5 各組大鼠L4DRG水平TRPV1和P2X3共表達及共沉淀情況Note. A. P2X3 and TRPV1 immunofluorescence diagram and double-labelling immunofluorescence diagram. B. TRPV1 and P2X3 co-immunoprecipitation diagram.Figure 5 Co-expression and co-immunoprecipitation of TRPV1 and P2X3 expressions at L4DRG levels of the rats in each group

3 討論

TRPV1和P2X3均是典型的配體門控非選擇性陽離子通道。在被激活的情況下，能快速誘導神經元產生沖動，發(fā)放動作電位[6]。研究表明，P2X3在自然界的主要配體是三磷酸腺苷(ATP)[7]，而TRPV1的天然配體為辣椒素。但與P2X3不同的是，TRPV1對辣椒素的敏感性受到pH值和溫度的直接影響[8]。在酸性環(huán)境和高溫下，TRPV1的敏感性明顯提升，僅需要小劑量的辣椒素即刻激活TRPV1。已有大量動物和人體研究表明，外周神經元上的TRPV1和P2X3是生物體感受外界傷害性刺激的主要受體之一[9-11]。二者的活化參與了從生理性疼痛到病理性疼痛，從炎性痛到神經病理痛等多種疼痛的產生和維持。已有大量研究者將二者視作鎮(zhèn)痛治療的主要外周靶點[12-13]。已有離體實驗報道，兩者在外周神經元上可能存在相互作用[4-5]。但是，尚未有研究在在體正常動物系統(tǒng)探討兩者之間的相互作用，及其是否會否影響機體對疼痛的感覺。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)激動TRPV1或P2X3能明顯提升P2X3或TRPV1的表達水平。但在痛覺表現(xiàn)上，TRPV1激活會明顯提升αβ-meATP誘導的自發(fā)痛，而P2X3對于capsaicin誘導的自發(fā)痛則無明顯改變。課題組認為，這種變化可能與不同受體對細胞興奮性影響的差異有關。雖然，TRPV1和P2X3均為非選擇性的陽離子通道。但是，兩者對細胞興奮性的影響明顯不同。大量研究報道，使用αβ-meATP激活DRG中小神經元表達的P2X3，最大內向電流均在1000 nA左右，即nA級別內向電流[14]。相應的，激活DRG中小神經元上的TRPV1，即使不使用最大劑量，也可以輕易獲得pA級別的電流[15]。在電流鉗模式下，以中間濃度激活P2X3獲得3次動作電位[16]，而激活TRPV1可以獲得7次動作電位[17]。即使考慮注射藥物劑量和濃度的差異，TRPV1也可以誘導遠超過P2X3的外周神經興奮。因此，課題組認為，雖然P2X3可以促進TRPV1的表達，但激活正常表達水平的TRPV1已可誘導出外周神經的最大興奮性。雖然TRPV1的表達量明顯增加，但外周神經的興奮性已飽和，因此無法觀察到自發(fā)疼痛的明顯增強。而P2X3則正好相反，激活正常表達量的P2X3尚不足以誘導外周神經興奮性飽和。因此，自發(fā)痛行為隨著P2X3表達的增多發(fā)生變化。至今，尚未有研究系統(tǒng)比較兩者激活后對神經元興奮性的影響，課題組將會繼續(xù)進行深入的研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，即使選擇高度特異性的抑制劑，capsazepine和TNP-ATP能部分抑制P2X3和TRPV1誘導的疼痛。這種作用可能源于兩種抑制劑通過對相應受體功能的抑制降低了外周神經的整體興奮性。也可能是兩種受體之間存在一定的相互關系，因而表現(xiàn)出這種特異性抑制劑的非特異性抑制作用。課題組通過免疫沉淀證實，兩種受體在分子水平存在一定的相互結合作用，提示兩者可能在功能水平存在交互作用，但需要更直接的證據(jù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在外周神經元水平，TRPV1和P2X3之間存在一定的相互作用。兩者可以相互促進對方的表達。當其中一方受到抑制時，另一方的功能也會相應的降低。以上結果提示，在疼痛，特別是慢性痛的產生和維持過程中，外周神經元水平的相關受體可能存在相互作用。本研究結果，為進一步研究外周神經在疼痛的作用提供了一種新的角度。