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    精神依賴(lài)物海洛因?qū)Υ笫笈咛グl(fā)育和腦組織Bax表達(dá)的影響

    2019-09-03 03:30:16俞發(fā)榮李建軍連秀珍李登樓謝明仁
    關(guān)鍵詞:子鼠孕鼠海洛因

    俞發(fā)榮,李建軍,連秀珍,李登樓,謝明仁

    (甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(甘肅政法大學(xué)),蘭州 730070)

    統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,精神依賴(lài)物海洛因?yàn)E用是目前濫用最嚴(yán)重,危害最大的毒品之一[1]。近年來(lái),在精神依賴(lài)物海洛因?yàn)E用的人群中,女性濫用人數(shù)明顯上升[2],其中育齡婦女約占1/5~1/3。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:精神依賴(lài)物海洛因在引起母體損傷[3]的同時(shí),可迅速通過(guò)胎盤(pán)屏障和胚胎血-腦脊液屏障,對(duì)胎兒產(chǎn)生毒性作用[4]。孕婦吸毒1 h后,在胎兒體內(nèi)測(cè)出有海洛因代謝產(chǎn)物嗎啡存在。海洛因可直接作用于胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期,導(dǎo)致胚胎組織器官發(fā)育不全或畸形[5]。前期研究發(fā)現(xiàn),海洛因成癮大鼠中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VAT)Bax基因表達(dá)水平明顯升高[6]。劉學(xué)紅等[7]應(yīng)用免疫組織化學(xué)法研究發(fā)現(xiàn),在人胚胎舌上皮組織細(xì)胞中均有Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá),說(shuō)明Bax基因參與調(diào)控人胚胎組織細(xì)胞的分化發(fā)育。Bax基因?qū)儆贐cl-2基因家族,Bax基因表達(dá)不僅拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用,而且具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能。若Bax基因表達(dá)異常,將導(dǎo)致胚胎組組織器官發(fā)育畸形[8]。本文在前期研究的基礎(chǔ)上,以Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,建立海洛因孕鼠模型,在大鼠胚胎發(fā)育期給予不同劑量的海洛因,觀察海洛因?qū)ε咛グl(fā)育及腦組織中Bax表達(dá)的影響,為研究精神依賴(lài)物海洛因的遺傳毒性機(jī)制積累參考資料。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    SPF級(jí)Wistar大鼠90只(雌60只,雄30只),體重200~210 g,來(lái)源于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心【SCXK(甘)2015-0001】。實(shí)驗(yàn)在甘肅政法大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行【SYXK(甘)2015-0006】。實(shí)驗(yàn)按3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人文關(guān)懷。倫理委員會(huì)審批號(hào):GZF-2019-002。

    1.1.2 試劑與儀器

    海洛因,含量86.8%,蘭州市公安局提供;Bax ELISA kit,上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司提供;酶標(biāo)儀, Thermo MK3公司提供。

    1.2 方法

    1.2.1 孕鼠分組、給藥

    全部大鼠在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室IVC飼育盒飼養(yǎng)7 d,雌:雄按2∶1合籠飼養(yǎng)。合籠第2天用光學(xué)顯微鏡觀察陰道拭子涂片,有精子者視為交配“受孕”。將“孕鼠”隨機(jī)分為:①對(duì)照組,10只孕鼠,肌肉注射生理鹽水2 mL/(kg·bw);②海洛因組高劑量組,肌肉注射海洛因64 mg/(kg·bw);③海洛因中劑量組,肌肉注射海洛因32 mg/(kg·bw);④海洛因低劑量組,肌肉注射海洛因16 mg/(kg·bw),每組10只孕鼠。各組均從受孕第7天開(kāi)始給藥,連續(xù)給藥9 d。

    1.2.2 胚胎子鼠發(fā)育觀察

    受孕第20天,乙醚麻醉孕鼠,無(wú)痛解剖開(kāi)腹部,全切取子宮檢查吸收胎、死胎及活胎數(shù),并對(duì)胎鼠進(jìn)行體表形態(tài)檢查。

    1.2.3 胚胎子鼠腦組織Bax水平檢測(cè)

    剝?nèi)「鹘M胚胎子鼠大腦額葉皮質(zhì)和小腦皮層,各稱(chēng)取500 mg,用勻漿研磨器研磨,離心機(jī)2000 r/min,離心15 min,取上清,用ELISA法檢測(cè)Bax水平。

    1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程制作

    以Bax標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),吸光度(OD)為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 海洛因?qū)Υ笫笈咛グl(fā)育的影響

    受孕第20天,解剖開(kāi)腹部,全切取子宮檢查胚胎數(shù)、死胎及活胎數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),海洛因高、中、低劑量組活胚胎總數(shù)比對(duì)照組減少了48.48%、37.12%和27.27%。(表1)

    活體檢查看出,海洛因低劑量組胚胎枕骨發(fā)育不全,胚胎出現(xiàn)腦膨出畸形;海洛因中劑量組胚胎枕骨、頂骨發(fā)育不全,胚胎腦膨出明顯;海洛因高劑量組胚胎枕骨、頂骨、顳骨發(fā)育不全,胚胎腦膨出更為明顯,部分胚胎出現(xiàn)四肢及指骨發(fā)育不全。(圖1)

    表1 海洛因?qū)Υ笫笈咛グl(fā)育的影響Table 1 Effect of heroin on the embryonic development of rats

    注A:對(duì)照組胚胎。B:海洛因低劑量組胚胎:枕骨發(fā)育不全,胚胎出現(xiàn)腦膨出畸形。C:海洛因中劑量組胚胎:枕骨、頂骨發(fā)育不全,胚胎腦膨出明顯。D:海洛因高劑量組胚胎:枕骨、頂骨、顳骨發(fā)育不全,胚胎腦膨出更為明顯。圖1 海洛因?qū)Υ笫笈咛グl(fā)育的影響Note. A, Embryos in the control group. B, Occipital bone hypoplasia, embryonic encephalocele deformity in the low dose heroin group. C, Embryos in the medium-dose heroin group: occipital and parietal bone hypoplasia, obvious embryonic encephalocele. D, Embryos in the high-dose heroin group: occipital, parietal and temporal bone hypoplasia, and more obvious embryonal encephalocele.Figure 1 Effect of heroin on embryonic development of the rats

    2.2 海洛因?qū)ε咛プ邮蟠竽X額葉皮層Bax表達(dá)水平的影響

    以Bax標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo),吸光度(OD)為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程。(圖2)

    將胚胎子鼠大腦額葉皮層OD代入直線回歸方程,海洛因低、中、高劑量組胚胎子鼠大腦額葉皮層中Bax水平比對(duì)照組增加了11.41%、47.06%和83.74%(P< 0.05,P< 0.01)。(圖3)

    圖2 Bax標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程Figure 2 Bax standard curve and linear regression equation of the standard curve

    2.3 海洛因?qū)ε咛プ邮笮∧X組織Bax表達(dá)水平的影響

    將小腦組織OD代入上述Bax直線回歸方程,海洛因低、中、高劑量組胚胎小腦組織中Bax表達(dá)水平比對(duì)照組增加了17.16%、52.96%和90.01%(P< 0.05,P< 0.01)。(圖4)

    注:與對(duì)照組比,*P<0.05,**P<0.01。下圖同。圖3 海洛因?qū)ε咛プ邮蟠竽X額葉皮層Bax表達(dá)水平的影響Note.*P< 0.05,**P< 0.01 vs. the control group.(The same in the following figures)Figure 3 Effect of heroin on Bax expression level in the rat embryonic brain tissue

    圖4 海洛因?qū)ε咛プ邮笮∧X組織Bax表達(dá)水平的影響Figure 4 Effects of heroin on Bax expression level in the rat embryonic cerebellar tissue

    3 討論

    近年研究表明,精神依賴(lài)物海洛因?yàn)E用嚴(yán)重影響母體健康[9],直接損害腦組織神經(jīng)元[10]、星形膠質(zhì)細(xì)胞[11]、顆粒細(xì)胞[12]和免疫系統(tǒng)[13],使血-腦脊液屏障的通透性發(fā)生改變,從而誘導(dǎo)大腦損傷和腦功能異常[14],引起周?chē)窠?jīng)損傷[15],導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生退行性病變[16]。王園園等[17]報(bào)道,孕婦濫用海洛因?qū)⒂绊懪咛ゴ竽X正常發(fā)育,影響子代的學(xué)習(xí)記憶能力[18]。李重陽(yáng)等[19]給小鼠仔鼠注射海洛因20 d, 仔鼠下丘腦和海馬凋亡細(xì)胞及Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的數(shù)明顯高于對(duì)照組,并隨著海洛因劑量的遞增陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量呈增多趨勢(shì)。許梓楓等[20]報(bào)道,海洛因?yàn)E用不僅影響胚胎正常發(fā)育,出現(xiàn)宮內(nèi)死胎、流產(chǎn)、早產(chǎn),增加新生兒及嬰兒死亡的概率,還使子代表觀遺傳性發(fā)生改變[21]。胚胎解剖發(fā)現(xiàn),給予孕鼠海洛因后,活胚胎率明顯降低,胚胎表型發(fā)育受到干擾。由于胚胎顱骨發(fā)育受到干擾,腦膨出畸形胚胎數(shù)顯著增加,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與許梓楓等報(bào)道結(jié)果相一致。ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),胚胎大腦組織細(xì)胞Bax表達(dá)水平隨給予海洛因劑量的增加而升高。結(jié)果提示,Bax基因是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的主要基因,Bax基因表達(dá)的蛋白可能抑制胚胎發(fā)育和組織器官的形成,或破壞胚胎新形成組織器官,出現(xiàn)畸形胚胎或死胎。海洛因通過(guò)母體干擾胚胎表型和組織器官的發(fā)育,誘導(dǎo)胚胎組織細(xì)胞Bax基因表達(dá)的分子生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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