• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    利用正交試驗(yàn)優(yōu)化建立大鼠條件恐懼記憶模型

    2019-09-03 03:30:16郭冷秋郭壯麗朱霄周蕾王夢(mèng)楠張立光周揚(yáng)
    關(guān)鍵詞:電擊恐懼條件

    郭冷秋,郭壯麗,朱霄,周蕾,王夢(mèng)楠,張立光,周揚(yáng)

    (1. 蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院,蘇州 215009; 2. 青島大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科, 青島 266003)

    隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和社會(huì)的進(jìn)步,情緒障礙性疾病(如焦慮、失眠、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等)的發(fā)病率呈現(xiàn)日益增高的趨勢(shì)。負(fù)性情緒(尤其是恐懼)記憶消除障礙是本類疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[1],探討如何有效消退由創(chuàng)傷經(jīng)歷引起的恐懼記憶、消除和降低病人的恐懼反應(yīng),具有重要的意義[2]??謶钟洃泟?dòng)物模型的建立是本類疾病發(fā)病機(jī)制研究和藥物研發(fā)的關(guān)鍵?;诎透β宸驐l件反射原理的條件恐懼(fear conditioning)模型是目前公認(rèn)的和應(yīng)用最為廣泛的恐懼記憶動(dòng)物模型[3]。該模型將條件刺激(中性刺激,CS,如:聲音)與非條件刺激(恐懼刺激,US,如:電擊)進(jìn)行多次匹配聯(lián)結(jié)(CS-US)訓(xùn)練后,即使單獨(dú)呈現(xiàn)CS 也可引發(fā)動(dòng)物的恐懼反應(yīng)[4]。CS-US連結(jié)訓(xùn)練是形成動(dòng)物恐懼反應(yīng)和建立恐懼記憶的關(guān)鍵。然而目前缺乏統(tǒng)一可循的標(biāo)準(zhǔn)和參考,不同的研究者往往采用不同的參數(shù)條件,導(dǎo)致模型的重復(fù)性和可借鑒性差,進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。本研究利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)選建立條件恐懼記憶模型的最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù);并對(duì)所建立的模型進(jìn)行恐懼記憶保持的短期(24 h)和長(zhǎng)期(1周、2周、4周和8周)水平檢測(cè),以考察優(yōu)選條件下建立的模型的可靠性和穩(wěn)定性,為相關(guān)研究提供可借鑒的實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

    6~8周齡清潔級(jí)SD大鼠,雄性,體重160~200 g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司【SCXK(滬)2012-2002】,飼養(yǎng)在蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室【SYXK(蘇) 2016-0049】。明暗周期為12 h/12 h(光照時(shí)間7:00~19:00)、室溫22~26℃條件,自由攝食和飲水。適應(yīng)7 d,期間每天由實(shí)驗(yàn)者撫摸大鼠3 min,并放入條件恐懼箱適應(yīng)5 min,取出后用75%酒精擦拭箱體以去除遺留氣味。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào):SWAE201902)。

    分組:(1)正交試驗(yàn):大鼠隨機(jī)分為9組,每組7~8只,按照正交試驗(yàn)表L9(34)安排實(shí)驗(yàn),三個(gè)因素分別為聲音強(qiáng)度(因素A)、電擊強(qiáng)度(因素B)和CS-US配對(duì)循環(huán)次數(shù)(因素C),每個(gè)因素各取三個(gè)水平,因素水平見(jiàn)表1,9個(gè)實(shí)驗(yàn)組具體參數(shù)安排見(jiàn)表2。(2)恐懼記憶保持測(cè)試:大鼠隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組,每組9只,模型組以實(shí)驗(yàn)(1)所確定的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行訓(xùn)練,對(duì)照組不進(jìn)行條件恐懼訓(xùn)練,其他條件同實(shí)驗(yàn)組。

    1.1.2 儀器設(shè)備

    Panlab條件恐懼與驚跳結(jié)合系統(tǒng)(Startle and Fear Combined System,美國(guó)Harvard公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 大鼠正常行為模式檢測(cè)

    實(shí)驗(yàn)大鼠在條件恐懼箱內(nèi)適應(yīng)3 min后,記錄20 min內(nèi)的活動(dòng)情況,計(jì)算木僵反應(yīng)時(shí)間占總測(cè)試時(shí)間的百分比(freezing time ratio)。連續(xù)記錄3 d,取3 d的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    1.2.2 大鼠對(duì)聲音(CS)的基礎(chǔ)反應(yīng)

    實(shí)驗(yàn)大鼠在條件恐懼箱內(nèi)適應(yīng)3 min后,不同組別大鼠按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表(見(jiàn)表2)分別給予相應(yīng)強(qiáng)度的CS,每次持續(xù)10 s,共10次,間隔90~150 s(平均120 s,隨機(jī)出現(xiàn))。記錄大鼠在CS持續(xù)時(shí)間內(nèi)的freezing time ratio。

    1.2.3 條件恐懼記憶模型的建立

    實(shí)驗(yàn)大鼠在條件恐懼箱適應(yīng)3 min后,按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表(見(jiàn)表2),進(jìn)行CS-US配對(duì)訓(xùn)練(CS持續(xù)10 s,結(jié)束之前0.5 s給予電擊(US),聲音電擊同時(shí)結(jié)束),此為一個(gè)循環(huán)(trial);此后每間隔90~150 s(平均120 s,隨機(jī)出現(xiàn))1個(gè)trial。統(tǒng)計(jì)大鼠在10個(gè)trial中的freezing time ratio。

    表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Experimental factors and levels

    1.2.4 恐懼記憶表達(dá)檢測(cè)

    條件恐懼記憶建立24 h后,再次將大鼠放入條件恐懼箱,3 min后給予訓(xùn)練時(shí)的CS(不給予US),共10次,每次持續(xù)10 s,間隔時(shí)間為120 s。統(tǒng)計(jì)大鼠在CS持續(xù)時(shí)間內(nèi)的freezing time ratio。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析,明確影響恐懼記憶形成的因素主次,確定最優(yōu)試驗(yàn)條件。

    1.2.5 恐懼記憶保持檢測(cè)

    利用上述實(shí)驗(yàn)確定的最優(yōu)試驗(yàn)條件,建立大鼠恐懼記憶模型,并對(duì)大鼠進(jìn)行短時(shí)(24 h)和長(zhǎng)時(shí)(1周、2周、4周和8周)恐懼記憶的保持檢測(cè)。方法同1.2.4。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠正?;顒?dòng)模式

    各組大鼠在條件恐懼建立前正?;顒?dòng)的freezing time ratio見(jiàn)圖1,單因素方差分析結(jié)果表明,各組之間差異無(wú)顯著性(P=0.9996,F(xiàn)=0.07885)。

    圖1 各組大鼠正?;顒?dòng)時(shí)木僵反應(yīng)時(shí)間百分比Figure 1 Freezing time ratio of the rats in each group during normal activities

    2.2 大鼠對(duì)CS的基礎(chǔ)反應(yīng)

    各組大鼠在CS持續(xù)時(shí)間內(nèi)freezing time ratio見(jiàn)圖2,單因素方差分析結(jié)果表明,各組之間差異無(wú)顯著性(P=0.9998,F(xiàn)=0.06774)。

    圖2 各組大鼠對(duì)CS的基礎(chǔ)反應(yīng)Figure 2 Basic response of the rats to CS in each group

    2.3 恐懼記憶的表達(dá)

    條件恐懼記憶建立后24 h各組大鼠freezing time ratio見(jiàn)表2。比較各因素的極差R,發(fā)現(xiàn)各因素影響能力排序?yàn)锳=C>B。其中5號(hào)實(shí)驗(yàn)(A2B2C3)結(jié)果最好,木僵時(shí)間達(dá)到82%,故建立大鼠條件恐懼模型最佳條件為A2B2C3,即聲音75 dB,電擊強(qiáng)度0.8 mA,循環(huán)15次;方差分析結(jié)果(表3)表明,因素C對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響(P< 0.05),因素A,B對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著(P> 0.05)。因此C為主要因素,A、B為次要因素。按照方差分析觀點(diǎn),只需對(duì)有顯著影響的因素選擇最佳水平,而其他對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小的因素,可按實(shí)際需要選擇適當(dāng)?shù)乃健R虼藢?shí)驗(yàn)中最優(yōu)條件是A2B2C3,與直觀分析結(jié)果一致。

    2.4 恐懼記憶的保持

    利用優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)參數(shù)建立條件恐懼記憶模型,在建模后的第24 h和1周時(shí),模型組大鼠freezing time ratio與對(duì)照組比較差異具有顯著性(P< 0.001和P< 0.05)。第2周后,恐懼記憶逐漸消退,與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

    表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析結(jié)果Table 2 Design of the orthogonal test and results of intuitive analysis

    表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

    注:恐懼記憶建立后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè),與對(duì)照組比較,*P< 0.05,***P< 0.001。圖3 恐懼記憶保持測(cè)試結(jié)果Note. Compared with the control group at different times after fear memories built up, *P< 0.05, ***P< 0.001.Figure 3 Results of the fear memory retention test

    3 討論

    建立具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性的動(dòng)物模型是研究疾病發(fā)病機(jī)制和治療藥物的前提和基礎(chǔ)。基于巴普洛夫條件反射原理的條件恐懼記憶動(dòng)物模型,廣泛用于恐懼癥、PTSD等恐懼相關(guān)性疾病的研究[5]。然而模型建立的成功與否受到諸多因素的影響,如電擊(US)的強(qiáng)度、聲音刺激(CS)強(qiáng)度及CS-US配對(duì)訓(xùn)練次數(shù)等。成功的模型以既能引起動(dòng)物產(chǎn)生明確的恐懼反應(yīng),且又不對(duì)動(dòng)物造成生理性的傷害為目標(biāo)[6]。目前各研究室采用的實(shí)驗(yàn)條件不盡相同,雖然都能在一定程度上反映動(dòng)物的恐懼記憶,但是不同條件建立的模型的穩(wěn)定性和持續(xù)性往往存在差異,因而難以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性和可靠性。宋海濱等[7]曾比較和評(píng)價(jià)了KM和C57BL/6小鼠在用不同電擊強(qiáng)度進(jìn)行訓(xùn)練時(shí)恐懼性記憶建立的差異;郭呈斌等[8]報(bào)道了足底電擊誘導(dǎo)樹(shù)鼩條件恐懼記憶模型的建立及抹除方法。但目前關(guān)于大鼠恐懼記憶建立的方法學(xué)評(píng)價(jià),尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究在文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上[9-12],利用正交試驗(yàn),考察和評(píng)價(jià)了電擊(US)強(qiáng)度、聲音(CS)強(qiáng)度和CS-US配對(duì)訓(xùn)練次數(shù)3個(gè)因素在3個(gè)不同水平上對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的。正交試驗(yàn)直觀分析表明,各因素影響能力依次為聲音強(qiáng)度=循環(huán)次數(shù)>電擊強(qiáng)度(表2);方差分析表明,循環(huán)次數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響(P< 0.05),聲音強(qiáng)度和電擊強(qiáng)度影響不顯著(P> 0.05)(表3)。因此確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件為:聲音75 dB,電擊強(qiáng)度0.8 mA,CS-US配對(duì)循環(huán)訓(xùn)練15次。模型穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果表明,大鼠在1周內(nèi)恐懼記憶保持良好,與對(duì)照組比較差異顯著;2周后,恐懼記憶逐漸消退,與對(duì)照組比較差異不顯著(圖3)。

    因CS-US配對(duì)訓(xùn)練次數(shù)是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯著因素,提示我們,若要建立穩(wěn)定表達(dá)的恐懼記憶動(dòng)物模型,可以適當(dāng)增加訓(xùn)練的次數(shù)或訓(xùn)練周期。表3可見(jiàn),電擊強(qiáng)度為1 mA時(shí)freezing time ratio最高為77%,而0.8 mA的結(jié)果為82%,提示并非電擊強(qiáng)度越大恐懼記憶表達(dá)越好,這種現(xiàn)象可能反映了應(yīng)激反應(yīng)的程度對(duì)記憶固化過(guò)程的影響,此結(jié)果與Anagnostaras等[13]的研究一致。此外,模型建立前我們還檢測(cè)了大鼠正常的活動(dòng)模式以及對(duì)CS的基礎(chǔ)恐懼反應(yīng),考察模型的可靠性。結(jié)果可見(jiàn),大鼠在條件恐懼建立后的freezing time ratio(表2)與正?;顒?dòng)模式(圖1)相比較有明顯提高;大鼠對(duì)CS的基礎(chǔ)反應(yīng)(圖2)與正?;顒?dòng)模式(圖1)比,無(wú)明顯變化。這些結(jié)果表明,CS-US配對(duì)訓(xùn)練后freezing time ratio的增加并非是對(duì)聲音的恐懼所導(dǎo)致的,而是條件恐懼記憶建立的結(jié)果。

    綜上所述,本研究明確了建立大鼠條件恐懼記憶模型影響因素的主次,優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件,并考察和評(píng)價(jià)了模型的穩(wěn)定性和可靠性,為條件恐懼記憶模型的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化及后續(xù)研究提供了可借鑒的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    猜你喜歡
    電擊恐懼條件
    戶外照明電擊防護(hù)的幾點(diǎn)建議
    排除多余的條件
    選擇合適的條件
    住校記:她在夢(mèng)里表達(dá)恐懼
    超級(jí)電擊武器
    恐懼更奇怪
    特別健康(2018年9期)2018-09-26 05:45:32
    恐懼
    恐懼的對(duì)立面
    特別健康(2018年2期)2018-06-29 06:13:42
    為什么夏天的雨最多
    電擊武器的非致命效應(yīng)研究
    午夜激情久久久久久久| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 9色porny在线观看| 丝袜美足系列| 老司机在亚洲福利影院| 久久精品国产a三级三级三级| 搡老岳熟女国产| 久久天堂一区二区三区四区| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久狼人影院| 蜜桃国产av成人99| 在线免费观看不下载黄p国产| 狂野欧美激情性bbbbbb| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产一卡二卡三卡精品 | 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品免费久久久久久久清纯 | 久久女婷五月综合色啪小说| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 尾随美女入室| 国产免费福利视频在线观看| 精品久久久久久电影网| 最近中文字幕高清免费大全6| www日本在线高清视频| 超碰97精品在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 91精品三级在线观看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 日韩伦理黄色片| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| av电影中文网址| 秋霞在线观看毛片| 久久久久久久久免费视频了| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 天堂8中文在线网| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产黄色视频一区二区在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 不卡视频在线观看欧美| 一区二区三区精品91| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产精品欧美亚洲77777| 男男h啪啪无遮挡| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 日韩成人av中文字幕在线观看| 99久久综合免费| 精品少妇久久久久久888优播| 国产精品久久久久成人av| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲,欧美精品.| 另类亚洲欧美激情| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 操美女的视频在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 午夜久久久在线观看| 欧美中文综合在线视频| 一本大道久久a久久精品| 婷婷色av中文字幕| 熟女av电影| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 精品久久久久久电影网| 好男人视频免费观看在线| 麻豆乱淫一区二区| 久久ye,这里只有精品| 亚洲欧洲国产日韩| 哪个播放器可以免费观看大片| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲色图综合在线观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 91精品国产国语对白视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 毛片一级片免费看久久久久| 18禁观看日本| 国产日韩欧美在线精品| 美女高潮到喷水免费观看| 日韩大码丰满熟妇| 日韩伦理黄色片| 午夜免费鲁丝| 久久久久久免费高清国产稀缺| h视频一区二区三区| 午夜福利视频在线观看免费| 国产成人精品在线电影| 亚洲天堂av无毛| av有码第一页| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 亚洲精品国产av成人精品| 97人妻天天添夜夜摸| 午夜日韩欧美国产| 丝袜在线中文字幕| 国产日韩欧美在线精品| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 看免费成人av毛片| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 九色亚洲精品在线播放| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久免费观看电影| www.熟女人妻精品国产| 亚洲四区av| 国产爽快片一区二区三区| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 一本大道久久a久久精品| 自线自在国产av| 国产一卡二卡三卡精品 | 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲五月色婷婷综合| 免费少妇av软件| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲天堂av无毛| av一本久久久久| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 99久久人妻综合| 亚洲国产日韩一区二区| 黄频高清免费视频| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲国产欧美网| 精品国产一区二区久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产高清不卡午夜福利| 看免费成人av毛片| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 黄频高清免费视频| 欧美97在线视频| 欧美在线黄色| 一级黄片播放器| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美乱码精品一区二区三区| 精品亚洲成国产av| 久久国产精品大桥未久av| 国产 一区精品| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美xxⅹ黑人| 最新在线观看一区二区三区 | 久久 成人 亚洲| 十八禁高潮呻吟视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 成人漫画全彩无遮挡| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产片内射在线| 亚洲av综合色区一区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产精品国产av在线观看| 一区在线观看完整版| 人妻人人澡人人爽人人| 18禁国产床啪视频网站| 精品国产一区二区久久| 国产亚洲av高清不卡| 十八禁网站网址无遮挡| 国产男女内射视频| 18禁观看日本| 男女边摸边吃奶| 高清不卡的av网站| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 成年女人毛片免费观看观看9 | 宅男免费午夜| 嫩草影视91久久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产亚洲一区二区精品| 高清欧美精品videossex| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 一区二区三区四区激情视频| www日本在线高清视频| 97人妻天天添夜夜摸| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品偷伦视频观看了| 操出白浆在线播放| 各种免费的搞黄视频| 高清av免费在线| 国产1区2区3区精品| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲,欧美,日韩| 国产男女超爽视频在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久久久久久精品精品| netflix在线观看网站| 蜜桃国产av成人99| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲成人av在线免费| 亚洲人成77777在线视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产欧美亚洲国产| 久久精品人人爽人人爽视色| av有码第一页| 国产男女超爽视频在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲欧美精品自产自拍| 成人亚洲精品一区在线观看| 青春草视频在线免费观看| 久久久久久久国产电影| 国产精品国产三级国产专区5o| 一级黄片播放器| 一级黄片播放器| 性色av一级| 婷婷成人精品国产| 欧美日韩精品网址| 日韩免费高清中文字幕av| 不卡av一区二区三区| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美乱码精品一区二区三区| 婷婷色综合www| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产精品久久久久成人av| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产av国产精品国产| 亚洲国产中文字幕在线视频| √禁漫天堂资源中文www| 午夜激情久久久久久久| 亚洲av福利一区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲精品乱久久久久久| 各种免费的搞黄视频| 亚洲精品乱久久久久久| 成人三级做爰电影| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 国产亚洲欧美精品永久| 久久午夜综合久久蜜桃| 91aial.com中文字幕在线观看| 女人久久www免费人成看片| 国产 一区精品| 电影成人av| 欧美精品一区二区免费开放| 最新在线观看一区二区三区 | 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 亚洲成色77777| 黄色一级大片看看| 精品国产露脸久久av麻豆| 久久久国产精品麻豆| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 最近中文字幕2019免费版| 电影成人av| 亚洲国产av新网站| 午夜老司机福利片| 黑人猛操日本美女一级片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲精品日本国产第一区| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久久精品免费免费高清| 蜜桃在线观看..| 在线精品无人区一区二区三| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲av电影在线进入| 国产精品一区二区在线观看99| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 人成视频在线观看免费观看| 精品福利永久在线观看| 美女大奶头黄色视频| a级毛片在线看网站| 国产激情久久老熟女| 国产1区2区3区精品| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产一区有黄有色的免费视频| 日韩一区二区视频免费看| 99re6热这里在线精品视频| 黑丝袜美女国产一区| 国产精品国产三级专区第一集| 精品久久久久久电影网| 国产精品三级大全| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产亚洲一区二区精品| av线在线观看网站| 国产又爽黄色视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 日本av免费视频播放| 99热国产这里只有精品6| 中国三级夫妇交换| 伦理电影免费视频| 亚洲国产最新在线播放| 久久ye,这里只有精品| 大码成人一级视频| 我的亚洲天堂| av国产久精品久网站免费入址| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产乱人偷精品视频| kizo精华| 啦啦啦 在线观看视频| 一区福利在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 晚上一个人看的免费电影| 伊人久久国产一区二区| 亚洲精品美女久久av网站| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 好男人视频免费观看在线| 亚洲精品在线美女| 欧美黑人精品巨大| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲av成人精品一二三区| 色视频在线一区二区三区| 色视频在线一区二区三区| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 黄色 视频免费看| 熟女av电影| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品 欧美亚洲| 欧美人与性动交α欧美软件| av线在线观看网站| 国产成人精品在线电影| 精品国产一区二区久久| 精品久久久精品久久久| 久久久久精品性色| 久久人人97超碰香蕉20202| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产精品 国内视频| 大码成人一级视频| 久久综合国产亚洲精品| 国产男人的电影天堂91| 嫩草影院入口| 老司机靠b影院| 亚洲成人国产一区在线观看 | 日韩一区二区三区影片| 十八禁高潮呻吟视频| 国产成人精品福利久久| 久久性视频一级片| 精品一区在线观看国产| 亚洲国产精品成人久久小说| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲成人av在线免费| bbb黄色大片| 亚洲 欧美一区二区三区| 97精品久久久久久久久久精品| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲精品乱久久久久久| 日韩免费高清中文字幕av| 丁香六月天网| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 晚上一个人看的免费电影| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 久久青草综合色| 久久精品久久久久久久性| 波野结衣二区三区在线| 国产男女内射视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲人成电影观看| 国产99久久九九免费精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲在久久综合| 日韩精品有码人妻一区| 一本大道久久a久久精品| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美精品一区二区大全| 一边亲一边摸免费视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 人妻人人澡人人爽人人| 国产精品久久久av美女十八| 欧美在线一区亚洲| 一级片'在线观看视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 午夜影院在线不卡| 成人毛片60女人毛片免费| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 韩国高清视频一区二区三区| 成年人免费黄色播放视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 91精品国产国语对白视频| 乱人伦中国视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | av线在线观看网站| kizo精华| 天天添夜夜摸| 国产精品偷伦视频观看了| 少妇的丰满在线观看| 好男人视频免费观看在线| 日韩视频在线欧美| 1024视频免费在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 新久久久久国产一级毛片| 男女免费视频国产| 国产亚洲最大av| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美日韩综合久久久久久| 伦理电影免费视频| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品二区激情视频| 成人黄色视频免费在线看| 91精品伊人久久大香线蕉| 新久久久久国产一级毛片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品午夜福利在线看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日本av免费视频播放| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲精品国产区一区二| 国产精品一区二区在线观看99| 中国三级夫妇交换| 一二三四在线观看免费中文在| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲av男天堂| 2021少妇久久久久久久久久久| 精品国产一区二区三区四区第35| 色精品久久人妻99蜜桃| 看免费av毛片| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美日韩综合久久久久久| 国产成人欧美在线观看 | 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲av欧美aⅴ国产| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 丝袜脚勾引网站| 国产精品久久久av美女十八| a级毛片在线看网站| 青青草视频在线视频观看| 伊人久久国产一区二区| 男女免费视频国产| xxxhd国产人妻xxx| 久久精品国产a三级三级三级| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 一区二区三区激情视频| 一区福利在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产一区亚洲一区在线观看| 婷婷色av中文字幕| 午夜福利免费观看在线| 久久久久精品国产欧美久久久 | 午夜影院在线不卡| 免费高清在线观看视频在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久久久久久久久久免费av| 蜜桃在线观看..| 又大又黄又爽视频免费| 最近的中文字幕免费完整| 久久99一区二区三区| netflix在线观看网站| 久久鲁丝午夜福利片| 久久影院123| 成年动漫av网址| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 韩国av在线不卡| 只有这里有精品99| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 看十八女毛片水多多多| av国产精品久久久久影院| 久久亚洲国产成人精品v| 黑人猛操日本美女一级片| 99久久人妻综合| 十八禁高潮呻吟视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 色播在线永久视频| 国产精品国产av在线观看| 日韩伦理黄色片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| √禁漫天堂资源中文www| 久久久久久久国产电影| 亚洲av日韩在线播放| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 男人舔女人的私密视频| 又大又爽又粗| 国产免费一区二区三区四区乱码| 深夜精品福利| 国产激情久久老熟女| 国产成人欧美| 国产av精品麻豆| 啦啦啦在线观看免费高清www| 在线观看www视频免费| 免费高清在线观看日韩| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲熟女毛片儿| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久99热这里只频精品6学生| h视频一区二区三区| 国产97色在线日韩免费| 国产精品一二三区在线看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 91老司机精品| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 少妇人妻久久综合中文| 啦啦啦啦在线视频资源| 电影成人av| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产淫语在线视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 青春草国产在线视频| 51午夜福利影视在线观看| 天美传媒精品一区二区| 日本欧美视频一区| 少妇人妻 视频| 久久精品久久久久久久性| 成人毛片60女人毛片免费| 国产1区2区3区精品| 国产成人一区二区在线| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲精品美女久久av网站| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美黑人欧美精品刺激| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 在现免费观看毛片| 欧美人与善性xxx| 美女扒开内裤让男人捅视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 一区二区三区精品91| 亚洲精品第二区| 国产成人精品在线电影| 看免费av毛片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲精品乱久久久久久| 国产在线一区二区三区精| 国产精品一国产av| 秋霞在线观看毛片| 欧美日韩成人在线一区二区| 曰老女人黄片| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日日爽夜夜爽网站| 少妇被粗大的猛进出69影院| 精品午夜福利在线看| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 下体分泌物呈黄色| 国产有黄有色有爽视频| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 成年动漫av网址| 中国三级夫妇交换| 精品人妻一区二区三区麻豆| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美日韩成人在线一区二区| a 毛片基地| 国产成人精品无人区| 老司机亚洲免费影院| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲成人手机| 美女高潮到喷水免费观看| 精品第一国产精品| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 午夜老司机福利片| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲精品久久午夜乱码| kizo精华| 国产精品欧美亚洲77777| 久久婷婷青草| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产成人系列免费观看| 中文字幕色久视频| av在线app专区| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 高清欧美精品videossex| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产熟女欧美一区二区| 日韩免费高清中文字幕av| 国产精品一区二区在线观看99| 啦啦啦在线免费观看视频4| 99re6热这里在线精品视频| 综合色丁香网| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 黄色毛片三级朝国网站| 岛国毛片在线播放| 精品一区二区三区av网在线观看 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| h视频一区二区三区| 亚洲av福利一区| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲免费av在线视频| 波多野结衣av一区二区av| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| av在线app专区| 中文字幕色久视频| 十八禁高潮呻吟视频| 七月丁香在线播放| 午夜福利视频在线观看免费| 成人国产av品久久久| 我要看黄色一级片免费的| 老司机影院毛片| 丝袜美足系列| 色网站视频免费| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产极品天堂在线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 日韩精品有码人妻一区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲av男天堂|