無菌APPswe/PS1ΔE9雙轉基因小鼠模型建立及腦內斑塊變化初步觀察

朱華，郭亞茜，杜曉鵬，李卓，秦川

(衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以記憶喪失和認知減退為主要臨床癥狀的大腦神經退行性疾病。特征性的病理學表現有：β 淀粉樣肽(β amyloid peptides，Aβ)沉積形成的老年斑和tau 蛋白過度磷酸化形成的神經原纖維纏結[1-2]。目前有關AD的病因仍然不明確且臨床上無有效的防治措施。隨著對腦-腸-微生物菌群(brain-gut-microbiota axis，BGM)概念的提出，腸道菌群對AD的調控作用越來越受到關注[3]，但目前缺乏菌群與特定基因關系研究的動物模型。APPswe/PS1ΔE9(PAP)雙轉基因阿爾茨海默病小鼠模型由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所比較醫(yī)學重點實驗室構建培育。該模型以 C57BL/6J小鼠為背景，含有人APPswedish 突變位點和人PS1ΔE9突變位點。其在3月齡出現學習和記憶缺陷，4.5月齡開始出現老年斑，12月齡出現大量老年斑，具有和 AD 患者相似的病理表型。是目前常用的AD動物模型[4]。本研究采用剖宮產技術對PAP小鼠進行無菌化，并對其病理表型進行初步觀察，為研究腸道菌群與AD間關系提供一種新的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

用于繁殖的PAP陽性雄鼠和野生型C57BL/6J雌鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2014-0004】。體重(20 ± 2)g，無菌帶乳ICR母鼠由本實驗室繁育。動物實驗在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所隔離設施內進行【SYXK-(京)2018-0004】。本實驗中動物的使用已獲得中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批準，批準號：ZH17003。

1.1.2 試劑與儀器

RIPA 裂解液購自江蘇碧云天公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸胺(APS)、Tris-HCl、甘氨酸、 TEMED、 Tween-20 購自美國Sigma 公司；N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺和丙烯酰胺購自美國Bio-Rad 公司；磷酸酶抑制劑購自美國 Thermo 公司；GAPDH、超敏二步法免疫組化檢測試劑盒及含有 DAPI的水溶性封片劑均購自北京中杉金橋公司。使用的主要儀器有：ZHJH-C1118C型超凈臺、凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)、組織脫水機、石蠟包埋機、石蠟切片機(德國Leica)、IQ5PCR儀(美國Bio-Rad 公司)。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠的準備

選擇10～16周齡經檢測為陽性的健康PAP雄性雜合子鼠10只，與經產的10～16周齡C57BL/6J雌鼠野生型小鼠1∶2進行交配，記錄交配日期。隔離器內無菌代乳鼠提前48 h交配。每日上下午檢查一次母鼠陰道口是否有陰栓。見有陰栓作為0天，開始計算孕期。已確診受孕的母鼠與雄鼠分開單獨飼養(yǎng)。

1.2.2 剖宮產凈化

小鼠受孕17 d開始密切觀察動物，當受孕小鼠食欲突然下降，煩躁不安，有作窩行為，經觸診其趾骨已打開5 mm左右，外陰潮紅并處于開口狀態(tài)，此時受孕小鼠已臨產，可進行子宮摘除術。剖宮產手術在36～38℃環(huán)境中進行：犧牲母鼠，快速分離子宮，連同止血鉗一起迅速轉入裝有2%過氧乙酸的渡槽，停留30 s，傳入隔離器內。傳入隔離器內的子宮用5% NaHCO3溶液中和子宮表面殘留的過氧乙酸后攤在紗布上，用帶齒鑷子將子宮及羊膜撕破，取出胎仔。迅速擦去胎仔鼻和口部的羊膜及羊水。健康的仔鼠開始張口呼吸，沒有呼吸的要輕輕觸壓胸部促其呼吸，必要時用鑷子輕夾尾根，使其發(fā)出叫聲，引發(fā)呼吸。開始呼吸的仔鼠將由紫紅色漸漸變?yōu)轷r紅色。

將呼吸正常的剖宮產仔鼠，放入代乳母鼠的原盒內。用代乳母鼠親仔的糞便連同墊料涂抹代乳仔鼠，使失去原氣味。此時留一部分親仔共同哺乳，待母鼠接受代乳后，可除去親仔。代乳仔鼠20～25 d離乳。

1.2.3 無菌狀態(tài)維持及檢測

離乳的小鼠轉移至其他隔離器飼養(yǎng)。每個月取隔離器內飼料、墊料、飲水、小鼠糞便送衛(wèi)健委實驗動物質量檢測中心進行無菌狀態(tài)檢測并出具正式報告。

1.2.4 轉基因陽性動物的鑒定

子代小鼠出生9～14 d內剪趾法標記，收集剪下的組織按照文獻[4]的方法進行基因型鑒定。

1.2.5 腦內斑塊染色

小鼠脫頸椎處死后取左半腦固定于福爾馬林溶液中24 h、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，制作厚度為5 μm橫斷面石蠟切片，隔3取1。切片貼到經多聚賴氨酸處理過的玻片上，按照文獻[4]的方法對9月齡無菌PAP轉基因陽性小鼠及同月齡SPF級小鼠海馬和皮層內斑塊進行免疫組化染色，觀察斑塊數量變化。切片光鏡下觀察后用 Aperio 切片掃描系統(tǒng)對切片進行掃描，隨機截取5個高倍視野(400×)，采用 Image-Pro PLUS 圖像分析系統(tǒng)對陽性細胞數和光密度值(IOD)進行分析。每只動物計數3張切片，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 剖宮產手術及代乳情況

用來交配的 20只母鼠中，13只觀察到有陰栓，其中一例母鼠在18.5 d自然分娩，其余12例實施剖宮產手術，剖得仔鼠66只(表1)。其中有3只為死胎ICR無菌母鼠不予代乳，其余63只用母鼠成功代乳至離乳。到離乳時存活60只，剖宮產存活率和例如存活率分別為95.45%和95.24%。

表 1 PAP 小鼠剖腹宮手術及代乳情況Table 1 Caesarean section and fostering results of the PAP mice

2.2 轉基因陽性動物的鑒定

部分無菌PAP小鼠基因鑒定結果見圖1，攜帶APPswe/PS1 基因的陽性鼠可見清晰 PCR 擴增條帶，與目的片段大小相符，陰性鼠無條帶(圖1)。剖出的陽性鼠在9月齡、12月齡安樂時可見盲腸巨大，符合無菌動物的生物學特性(圖2)。

2.3 無菌狀態(tài)維持及檢測

按照GB/T14926.41、43-2001，GB14922.2-2011進行無菌狀態(tài)檢測。檢測結果合格(圖3)。

2.4 腦內斑塊檢測

9月齡無菌化PAP小鼠(圖4A)及SPF級(圖4B)腦內斑塊含量免疫組化結果。無菌PAP小鼠海馬內斑塊減少，皮層內斑塊數量未見顯著性差異(表2)。

圖1 部分PAP小鼠PCR鑒定凝膠電泳圖Figure 1 PCR identification of a part of PAP mice by gel electrophoresis

圖2 無菌PAP小鼠的盲腸Figure 2 Cecum of the germ-free PAP mice

圖3 PAP小鼠剖宮產凈化后無菌檢測結果Figure 3 Pathogen test results after caesarian section in the PAP mice

組別Groups海馬Hippocampus皮層Cortex陽性細胞數Number of positive cells光密度值IOD陽性細胞數Number of positive cells光密度值IOD無菌PAP小鼠Germ-free PAP mice11.32 ± 3.73*1987.64 ± 79.62*8.57 ± 2.881431.62 ± 132.113SPF級PAP小鼠SPF PAP mice17.46 ± 3.782864.37 ± 198.459.24 ± 2.621716.71 ± 159.71

注：與SPF級PAP小鼠相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the SPF PAP mice，*P< 0.05.

圖4 PAP小鼠腦內斑塊檢測結果Figure 4 IHC staining of senile plaques in brain tissues of the PAP mice

3 討論

無菌動物是指通過無菌剖宮產手術或無菌胚胎移植進行無菌化獲得的動物，利用無菌飼養(yǎng)方法維持于無菌隔離器，利用現有方法檢測不到活的微生物和寄生蟲的動物[5]。作為微生物背景最清晰的動物，可對菌群、基因及飲食等環(huán)境因素進行有效控制，是研究腸道菌群(gut microbiota，GM)對人類疾病及健康影響的最有效動物模型之一[6-7]。遺傳工程動物是研究是研究特定基因功能的重要工具，將無菌動物技術與遺傳工程動物結合建立無菌化小鼠人類疾病動物模型，可揭示某種特定基因引起的表型變化與腸道菌群之間的關系，為研究腸道菌群與疾病關系提供了更多的模型選擇。

無菌動物有自己的生物學特點：發(fā)育和體重增長緩慢，每窩產仔數減少[8]。PAP雙轉小鼠作為基因工程動物，由于基因組經過人工改造，繁殖力和免疫力都受到影響。因此與其他常規(guī)品系小鼠剖腹凈化及動物相比，剖宮產及動物繁育過程中有更多需要注意的操作細節(jié)：①微生物質量控制：剖宮產凈化的一個缺點是不能去除可通過胎盤垂直傳播的病原體，因此在選擇用來交配的轉基因和野生型小鼠時就要進行嚴格的微生物質量控制：選用符合SPF級動物標準的PAP雄鼠和野生型雌鼠；孕鼠的交配在SPF級設施內進行；盡量避免由動物本身帶來的污染。②嚴格無菌操作：剖宮產手術在超凈臺內完成，手術中嚴格執(zhí)行無菌操作：超凈臺除紫外燈照射消毒外，還要用酒精擦拭臺面。高壓滅菌的手術器械在超凈臺內才能打開，保證每只孕鼠一套手術器械，連續(xù)手術時兩個手術之間也要對臺面進行消毒。因超凈臺內有氣流，剖宮產手術在電熱毯上進行以保證適宜溫度。③剖宮產時機的選擇：經產鼠的孕期較初產鼠的準確，但仍不宜以見栓后天數為主要剖宮產指征，必需結合動物的表現進行判斷。實施剖宮產手術12只動物的孕期從17.5 d到21 d不等，差異很大。我們的經驗是在17 d左右開始仔細觀察動物，當受孕小鼠食欲突然下降，煩躁不安，有作窩行為，外陰潮紅并處于開口狀態(tài)，結合觸診經判斷趾骨已打開5 mm左右時為最佳剖宮產時機。

本研究中由于技術人員剖宮產技術操作熟練、注重操作細節(jié)及無菌動物每窩產仔數少但成活率高生物學特性等原因，剖宮產存活率(95.45%)與離乳存活率(95.24%)均較高，但孕鼠每胎產仔數低于封閉群及單轉基因小鼠剖宮產凈化相關文獻[9-11]，可能與雙轉基因動物繁殖能力降低有關。無菌動物的體重增長較緩慢，為模型小鼠后期的正常發(fā)育，我們延長了小鼠離乳的時間。經剖宮產凈化的PAP小鼠腦內斑塊含量發(fā)生改變，提示腸道菌群可能與斑塊形成有關，相關研究正在進行中。

本研究將無菌技術應用于研究阿爾茨海默癥常用的APPswe/PS1雙轉基因小鼠，建立了無菌化PAP小鼠模型，為研究腸道菌群與阿爾茨海默癥之間的關系提供一種新的動物模型。