3種新型蛋白酶體抑制劑對(duì)斑馬魚(yú)心臟毒性的評(píng)價(jià)

胡丙雪，董 雪，范宏偉，朱永強(qiáng)，張 茵，張 朝

（南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省分子與醫(yī)學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210023）

近年來(lái)，斑馬魚(yú)作為模式生物在藥物研發(fā)、藥物安全性、毒性和有效性評(píng)價(jià)及疾病模型建立等方面得到了很大應(yīng)用。較之于傳統(tǒng)嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型，斑馬魚(yú)在諸多方面具有優(yōu)勢(shì)，包括在基因和病理特征等方面與人類(lèi)的高度同源性，實(shí)驗(yàn)周期短，適于高通量應(yīng)用以及胚胎期呈透明可實(shí)時(shí)觀察心臟形態(tài)［1-4］。一些研究已經(jīng)證實(shí)，斑馬魚(yú)在體內(nèi)篩選心血管毒性方面是一種具有高度預(yù)測(cè)性的動(dòng)物模型［5-8］。在毒性刺激下，斑馬魚(yú)心臟會(huì)出現(xiàn)心包水腫、心室變小、心動(dòng)過(guò)緩、血流緩慢、心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)也會(huì)受到不同程度的影響［5-10］。

Carfilzomib（卡非佐米，商品名：Kyprolis?）和Ixazomib（伊沙佐米，商品名：Ninlaro?）是已上市的第2代蛋白酶體抑制劑類(lèi)抗腫瘤藥物，分別于2012年和2015年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療難治性多發(fā)性骨髓瘤（relapsed refractory multiplemyeloma，RRMM）。然而，在 carfilzomib和 ixazomib的應(yīng)用過(guò)程中有心臟不良事件的發(fā)生［11-13］，而在carfilzomib的使用說(shuō)明書(shū)中，心搏停止、充血性心衰、心肌缺血等心臟不良反應(yīng)也被列在了注意事項(xiàng)與副作用的第一條。NNU395是在carfilzomib結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上改構(gòu)合成的新的蛋白酶體抑制劑，而NNU458和NNU459是在ixazomib結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上改構(gòu)而來(lái)（圖1）。前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，改構(gòu)合成的化合物較之前體具有更強(qiáng)的抑制蛋白酶體的活性，更好的抗腫瘤效果和更低的副作用，但3種化合物對(duì)心臟的毒性作用仍有待考察。

本研究以模式生物斑馬魚(yú)作為研究對(duì)象，通過(guò)在體內(nèi)水平初步評(píng)價(jià)全新合成的新型蛋白酶體抑制劑NNU395、NNU458和NNU459的心臟毒性，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為藥物研發(fā)過(guò)程中心臟毒性風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

NNU395、NNU458和 NNU459由南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院朱永強(qiáng)教授實(shí)驗(yàn)室自主合成，純度大于95%，用DMSO溶解為10 mmol／L母液后再用斑馬魚(yú)養(yǎng)殖水稀釋至所需實(shí)驗(yàn)濃度。TRIzol RNA提取試劑（美國(guó)賽默飛世爾公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）；PCR熒光定量試劑盒ChamQ SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）。

1.2 儀 器

TI-S熒光倒置顯微鏡（日本尼康公司）；MVX10熒光體視顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

2 方 法

2.1 斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖與處理

年齡小于6 hpf（6 hours post fertilization）的 TU（Tuebingen）系斑馬魚(yú)卵由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所趙慶順實(shí)驗(yàn)室提供。挑選所需數(shù)量正常發(fā)育的斑馬魚(yú)卵置于六孔板中，用專(zhuān)用養(yǎng)殖水在溫度（28±1）℃、pH（7.0±0.5）、14 h明／10 h暗光照周期條件下培養(yǎng)。斑馬魚(yú)卵培養(yǎng)至6 hpf時(shí)，培養(yǎng)液更換為含不同濃度待測(cè)化合物的養(yǎng)殖水。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，carfilzomib的給藥濃度為5、10、50、100、150、200、250 和 300 μmol／L，NNU395給藥濃度為 1，10，50，100，120，150，200，220和 250μmol／L，ixazomib的給藥濃度為5，10，20，30，40和 50 μmol／L，NNU458和NNU459的給藥濃度為 0.1，1，10，20，30，40和50μmol／L，同時(shí)設(shè)置不含化合物的純養(yǎng)殖水培養(yǎng)的對(duì)照組，給藥時(shí)間為6～72 hpf，每隔12 h顯微鏡下挑出死卵并統(tǒng)計(jì)。

2.2 斑馬魚(yú)心臟形態(tài)的觀察與心率統(tǒng)計(jì)

培養(yǎng)至72 hpf時(shí)斑馬魚(yú)卵基本全部孵化，此時(shí)將培養(yǎng)液全部更換為正常養(yǎng)殖水，置于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)不同濃度實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的死亡數(shù)。斑馬魚(yú)死亡標(biāo)準(zhǔn)參照OECD（No.212）指導(dǎo)原則為判斷依據(jù)：以斑馬魚(yú)胚胎靜止不動(dòng)、心臟停止跳動(dòng)、身體變白、不透明或半透明、對(duì)機(jī)械刺激無(wú)反應(yīng)為依據(jù)判斷為死亡。小心地逐個(gè)挑出存活的斑馬魚(yú)于蓋玻片上，顯微鏡下觀察并拍攝斑馬魚(yú)的心臟形態(tài)，同時(shí)計(jì)算其每分鐘的心跳數(shù)。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

收集足夠數(shù)量的（約50只）72 hpf的斑馬魚(yú)（對(duì)照組和給藥組）于研缽中，加入液氮進(jìn)行研磨，將斑馬魚(yú)組織磨碎后加入TRIzol進(jìn)行裂解，然后加入氯仿渦旋后離心后得RNA沉淀，最后加入異丙醇與乙醇洗滌RNA沉淀，60℃孵育RNA沉淀使其溶解。測(cè)定RNA濃度后經(jīng)兩步法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)各基因序列設(shè)計(jì)并合成引物，各基因序列如下：has2 F序列：GCTGCTCCAAGATGAGATGTG，R序列：CCCACAAGCAGTGAAATGCC；amhcF序列：ATTCAAGCTAACCCTGCGCT，R序列：GCTCGTCCCGAAATGAATGC；vmhcF序列：TGGTGCACATCAGACAAGGC，R 序 列：TGTCACCTTCACGACTGACG；hand2 F序列：GGCGAAAGAAGGAAATGAATGACG，R序列：TTCAGCTCCAATGCCCAAAC；gata5 F序列：CGCAAACCAAAGATGCCCAA，R序列：AACTGTGTCGATGCCTGTGT；cmlc2 F序列：CCAGAGGAAACCATCCTTGCT，R序列：TGGTCAACCTCTTCTGCTGTG；nkx2.5 F 序 列：TGCTTCAGGCTTTTACGCGA，R 序 列：TCCTGACAAAACCCGATGTCTTTTT；β-actin F序列：AATCCCAAAGCCAACAGA，R序列：GATACCGCAAGATTCCATAC。按照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增PCR，記錄CT值，以β-actin作為管家基因進(jìn)行校準(zhǔn)后，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組基因相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

3 結(jié) 果

3.1 3種新型蛋白酶體抑制劑對(duì)斑馬魚(yú)死亡率的影響

圖2是 3種化合物 NNU395、NNU458及NNU459及各自改構(gòu)前體對(duì)斑馬魚(yú)致死率的量效曲線，可見(jiàn)5種化合物均濃度依賴(lài)性的增加了胚胎期斑馬魚(yú)的死亡率。圖2-A可以看出50μmol／L NNU395還未能引起斑馬魚(yú)胚胎的死亡，但同濃度的carfilzomib對(duì)斑馬魚(yú)的致死率已大于15%。當(dāng)NNU395濃度為100μmol／L時(shí)致死率小于10%，而同濃度的carfilzomib的致死率已大于50%。之后隨著NNU395濃度升高致死率逐漸上升，濃度由150μmol／L增加到200μmol／L時(shí)，致死率上升的比較明顯，而當(dāng)濃度為250μmol／L時(shí)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚(yú)在72 hpf時(shí)已全部死亡（圖2-A）。同時(shí)經(jīng)Hill方程擬合得到NNU395及其改構(gòu)前體carfilzomib的 LC50分別為（179.7±12.2）和（91.9±17.0）μmol／L，NNU395的 LC50約是 carfilzomib的2倍，說(shuō)明NNU395較之其改構(gòu)前體carfilzomib具有更低的毒性。

圖 2-B可以看出，濃度為 10μmol／L時(shí)，NNU458的致死率為0%，ixazomib和 NNU459的略高一些。濃度為20μmol／L時(shí)，NNU458和NNU459的致死率仍然不高（低于30%），而ixazomib的致死率已接近50%。但濃度達(dá)30μmol／L時(shí)3種化合物的致死率都有一個(gè)急劇的上升，而濃度升高至40μmol／L時(shí)，3種化合物的致死率都已接近100%。同時(shí)經(jīng)Hill方程擬合得到3種化合物的LC50分別為（21.5±2.4）μmol／L（ixazomib），（27.5±1.3）μmol／L（NNU458）和 （24.4 ±2.6）μmol／L（NNU459）。該部分的結(jié)果顯示，與前期電生理及大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致（數(shù)據(jù)略），改構(gòu)后的待測(cè)化合物NNU395，NNU458和NNU459較之各自前體都具有更低的毒性，接下來(lái)將繼續(xù)考察3種待測(cè)化合物對(duì)斑馬魚(yú)的心臟毒性。

Figure 2 Effects of carfilzomib，NNU395，ixazomib，NNU458 and NNU459 on embryonic mortality in zebrafish（xˉ±s，n=2 3）.Zebrafish embryos were treated with carfilzomib at the concentrations of 5，10，50，100，150，250 and 300μmol／L；NNU395 at the concentrations of 50，100，120，150，200，220 and 250μmol／L；ixazomib at the concentrations of5，10，20，30，40 and 50μmol／L；NNU458 and NNU459 at the concentrations of 10，20，30，40 and 50μmol／L from 6 hpf to 72 hpfA：Concentration-response curve for carfilzomib and NNU395 treatment；B：Concentration-response curves for ixazomib，NNU458 and NNU459 treatment.Two or three replicates of15 embryoswere used for each concentration assay

3.2 3種新型蛋白酶體抑制劑對(duì)斑馬魚(yú)心臟形態(tài)的影響

當(dāng)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至72 hpf時(shí)，對(duì)照組的斑馬魚(yú)發(fā)育正常，從卵中孵化出幼魚(yú)，心臟形態(tài)無(wú)異常（圖 3-A）。50μmol／L（圖 3-B）和 100μmol／L（圖3-C）的NNU395處理后，斑馬魚(yú)心臟形態(tài)也無(wú)明顯異常，而當(dāng)NNU395濃度增加至120μmol／L（圖3-D）和150μmol／L（圖3-E）時(shí)，斑馬魚(yú)心臟出現(xiàn)心包腔水腫和心臟畸形。當(dāng)濃度繼續(xù)升高達(dá)到200μmol／L，斑馬魚(yú)心臟出現(xiàn)更嚴(yán)重的畸形，包括心室變小、心包腔液體滲出和血流緩慢甚至無(wú)血液循環(huán)等形態(tài)學(xué)變化（圖3-F）。

0.1、1和10μmol／L的NNU458組的斑馬魚(yú)心臟發(fā)育正常（圖4-B～3-D），同對(duì)照組相比無(wú)明顯變化（圖4-A），30μmol／L的 NNU458組斑馬魚(yú)出現(xiàn)明顯的心包腔水腫（圖4-E）。0.1和1μmol／L NNU459處理后，斑馬魚(yú)心臟也無(wú)明顯異常（圖4-F和4-G）。10μmol／L NNU459組的斑馬魚(yú)出現(xiàn)輕微的心包水腫和心室變?。▓D4-H），30μmol／L NNU459組斑馬魚(yú)出現(xiàn)明顯的心包水腫（圖4-I）。

3.3 3種新型蛋白酶體抑制劑對(duì)斑馬魚(yú)心率的影響

如表1所示，未給藥的對(duì)照組斑馬魚(yú)的平均心率為（158±3）min-1，與對(duì)照組相比，50和100μmol／L NNU395處理后的斑馬魚(yú)心率略有降低，但與對(duì)照相比差異無(wú)顯著性。隨著NNU395濃度升高，斑馬魚(yú)心率逐漸顯著降低，200μmol／L NNU395處理后的斑馬魚(yú)平均心率只有（90±7）min-1（P＜0.05）。

Figure 3 Effect of NNU395 on cardiacmorphology in zebrafishZebrafish embryos were treated with different concentrations of NNU395 from 6 hpf to 72 hpf（Scale bar：400μm.Arrows point to pericardial edema or cardiacmalformation）A：Normal control；B，C，D，E and F：50，100，120，150 and 200μmol／L NNU395 groups，respectively

Figure4 Effects of NNU458 and NNU459 on cardiacmorphology in zebrafishZebrafish embryoswere treated with different concentrationsof NNU458 and NNU459 from 6 hpf to72 hpf（Scale bar：400μm.Arrows point to pericardial edema）A：Normal control；B，C，D，and E：0.1，1，10 and 30μmol／LNNU458 groups，respectively；F，G，H and I：0.1，1，10 and 30μmol／LNNU459 groups，respectively

Table 1 Effect of NNU395 on the heart rate of zebrafish at 72 hpf.Zebrafish embryoswere treated with different concentrations of NNU395 from 6 hpf to 72 hpf（±s，n=8）

Table 1 Effect of NNU395 on the heart rate of zebrafish at 72 hpf.Zebrafish embryoswere treated with different concentrations of NNU395 from 6 hpf to 72 hpf（±s，n=8）

***P＜0.001 vs NNU395 0μmol／L group

c（NNU395）／（μmol／L） Heart rate／min-1 158±3 50 155±6 100 153±7 120 139±11***150 129±15***200 90±7 0***

如表2所示，與對(duì)照組相比，0.1～30μmol／L的NNU458處理后，斑馬魚(yú)心率顯著降低。0.1和1μmol／L NNU459組的斑馬魚(yú)心率無(wú)顯著變化，而10～30μmol／L的NNU459處理后斑馬魚(yú)心率顯著降低（P＜0.05）。

3.4 3種新型蛋白酶體抑制劑對(duì)斑馬魚(yú)心臟發(fā)育基因表達(dá)的影響

為了考察化合物對(duì)斑馬魚(yú)心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響，基于3種待測(cè)化合物對(duì)斑馬魚(yú)的LC50，選取略低于各自LC50的一個(gè)濃度作為考察濃度，即 150μmol／L NNU395，20μmol／L NNU458或NNU459。檢測(cè)基因包括：has2（心內(nèi)膜特異性標(biāo)記物，限制性存在于大約48 hpf的瓣膜形成區(qū)域），amhc（心房特異性表達(dá)基因），vmhc（心室前體細(xì)胞的標(biāo)志），hand2（基本螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，在側(cè)板中胚層的心源性區(qū)域以及后來(lái)的心肌以及鰓弓中表達(dá)），gata5（在晚期囊胚階段表達(dá)于內(nèi)胚層祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于內(nèi)胚層和心臟的發(fā)育是必需的），cmlc2（心房前體細(xì)胞和心室前體細(xì)胞的前體標(biāo)記物），nkx2.5（心臟區(qū)域的標(biāo)記基因，參與心臟環(huán)化，心肌細(xì)胞分化和增殖，心臟形態(tài)發(fā)生）［5］。圖 5可以看出，150μmol／L NNU395，20μmol／L NNU458或NNU459對(duì)斑馬魚(yú)心臟發(fā)育相關(guān)的各基因的表達(dá)都無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

Table 2 Effects of NNU458 and NNU459 on the heart rate of zebrafish at72 hpf.zebrafish embryoswere treated with different concentrations of NNU458 or NNU459 from 6 hpf to 72 hpf（±s，n=8）

Table 2 Effects of NNU458 and NNU459 on the heart rate of zebrafish at72 hpf.zebrafish embryoswere treated with different concentrations of NNU458 or NNU459 from 6 hpf to 72 hpf（±s，n=8）

**P＜0.01，***P＜0.001 vs NNU458 and NNU459 0μmol／L group，respectively

c／（μmol／L） NNU458 Heart rate／min-1 NNU459 Heart rate／min-1 172±5 203±5 0.1 163±6** 204±5 1 164±6** 195±10 10 162±7** 171±5***20 158±10** 170±8***30 147±6*** 156±1 0***

Figure 5 Effects of NNU395，NNU458 and NNU459 on the expression of genes involved in heart development.Zebrafish embryoswere treated with 150μmol／LNNU395，20μmol／L NNU458 or NNU459 from 6 hpf to 72 hpf.The expression of genes was shown as fold change compared with untreated control groups after normalized toβ-actin.Five to seven replicates of50 embryos were used for each assay（±s，n=5 7）

4 討 論

NNU395、NNU458和 NNU459是在已上市的抗腫瘤藥物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上改構(gòu)并全新合成的蛋白酶體抑制劑，蛋白酶體抑制劑的抗腫瘤原理主要是通過(guò)抑制蛋白酶體的活性，導(dǎo)致促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白平衡的改變，包括腫瘤抑制蛋白的積累，從而造成細(xì)胞周期受阻和細(xì)胞凋亡［14］。然而，在心肌細(xì)胞中，蛋白酶體在維持胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用，對(duì)其的藥理抑制很可能會(huì)影響正常的心臟功能［15-16］。事實(shí)上，在已上市的蛋白酶體抑制劑類(lèi)抗腫瘤藥物的使用過(guò)程中確實(shí)存在著心臟毒性的報(bào)道［12-13］。因此，評(píng)價(jià) NNU395、NNU458和NNU459這3種新型蛋白酶體抑制劑的心臟毒性尤為必要。

目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的關(guān)于藥物心臟安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)主要包括兩個(gè)方面，一是以大鼠或犬類(lèi)為動(dòng)物模型研究藥物對(duì)心血管系統(tǒng)產(chǎn)生的副作用，另一方面則是研究藥物對(duì)HERG鉀離子通道的阻斷作用［17-18］。前期的電生理實(shí)驗(yàn)表明，3種化合物均呈濃度依賴(lài)性的抑制HERG通道的尾電流，但3種化合物對(duì)HERG通道的半數(shù)抑制濃度都高于各自改構(gòu)前體（數(shù)據(jù)略），即心臟安全性更高，因此本研究主要考察了3種改構(gòu)化合物對(duì)斑馬魚(yú)的心臟毒性。由于藥物心臟毒性評(píng)價(jià)的傳統(tǒng)動(dòng)物模型具有耗時(shí)長(zhǎng)、花費(fèi)高等缺點(diǎn)，而斑馬魚(yú)被推薦為一種新型的哺乳動(dòng)物心血管疾病及藥物心臟毒性評(píng)價(jià)模型［19-20］，本研究選用斑馬魚(yú)作為動(dòng)物模型，對(duì)待測(cè)化合物的心臟毒性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

本研究從 NNU395、NNU458和 NNU459對(duì)斑馬魚(yú)胚胎心臟形態(tài)和功能等方面的影響考察了化合物的心臟毒性。研究結(jié)果表明3種化合物均濃度依賴(lài)性地增加了斑馬魚(yú)的死亡率，但較之各自改構(gòu)前體毒性更低。低于致死濃度的3種化合物對(duì)斑馬魚(yú)的心臟形態(tài)都沒(méi)有明顯的影響，但當(dāng)化合物濃度高于致死濃度尤其是半數(shù)致死濃度LC50時(shí)，化合物致使斑馬魚(yú)心臟出現(xiàn)明顯的心包水腫、心室變小、心包腔液體滲出和血流緩慢甚至無(wú)血液循環(huán)等形態(tài)學(xué)變化。3種化合物還不同程度的引起斑馬魚(yú)心臟的心率降低，心率是心功能的重要指標(biāo)之一，有研究表明在人體中能引起QT間期延長(zhǎng)的藥物可引起斑馬魚(yú)心動(dòng)過(guò)緩［21］，可見(jiàn)高濃度的3種待測(cè)化合物對(duì)斑馬魚(yú)具有心臟毒性。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，能引起斑馬魚(yú)心臟形態(tài)改變或心率降低的NNU395的濃度（50μmol／L）遠(yuǎn)高于（大于10倍）其改構(gòu)前體carfilzomib在臨床使用過(guò)程中病人血漿的血濃峰值，間接說(shuō)明了NNU395具有潛在的臨床應(yīng)用安全性。同時(shí)，能引起斑馬魚(yú)心臟形態(tài)改變的NNU458和NNU459的濃度也遠(yuǎn)高于其改構(gòu)前體ixazomib臨床應(yīng)用時(shí)的cmax。但是，能引起斑馬魚(yú)心率顯著降低的NNU458濃度（0.1μmol／L）在ixazomib的cmax內(nèi)?？紤]到斑馬魚(yú)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程雖然并不能完全模擬人體，但仍具有一定的參考價(jià)值，因此臨床使用過(guò)程中應(yīng)注意濃度的選擇，并密切監(jiān)察病人尤其是有心臟病史的病人的心血管功能。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，3種化合物對(duì)心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明化合物對(duì)斑馬魚(yú)心臟形態(tài)和心功能的影響可能與影響發(fā)育基因的表達(dá)無(wú)關(guān)，具體通過(guò)何種機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

致謝：南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所趙慶順教授對(duì)斑馬魚(yú)的提供及相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)給予指導(dǎo)。