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    3-甲基腺嘌呤通過抑制自噬促進(jìn)小鼠毛囊再生的作用研究

    2019-08-28 01:27:08羅福玲吳盛旺萬敬員趙恒光
    中國藥科大學(xué)學(xué)報 2019年4期
    關(guān)鍵詞:毛囊毛發(fā)孵育

    李 婧,羅福玲,吳盛旺,萬敬員,趙恒光

    (1重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,重慶400016;2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部,重慶400016;3重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,重慶400016;4重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科,重慶400016)

    脫發(fā)是臨床常見病,發(fā)病率逐年上升,嚴(yán)重影響患者容貌和生活質(zhì)量。臨床上休止期脫發(fā)的產(chǎn)生,與毛囊休止期的過度延長有關(guān)[1],因此,尋找一種可以促進(jìn)毛囊由休止期向生長轉(zhuǎn)化的藥物,是休止期脫發(fā)疾病研究的重要方向之一。

    自噬是機(jī)體吞噬衰老細(xì)胞器或大分子物質(zhì)的一個降解過程,這些物質(zhì)通過自噬過程在溶酶體中降解為氨基酸、脂肪酸以及核苷酸并可被重復(fù)利用,在維持細(xì)胞自身的物質(zhì)平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要作用[2]。近年研究發(fā)現(xiàn),自噬紊亂會導(dǎo)致多種疾病,包括脫發(fā),而維持適當(dāng)穩(wěn)定的自噬水平則有助于促進(jìn)毛發(fā)再生[3-5]。

    拔毛法是目前普遍采用的一種生長期誘導(dǎo)模型,拔毛可誘導(dǎo)功能正常的毛囊快速轉(zhuǎn)化進(jìn)入生長期,并重新長出新發(fā)[6]。

    為進(jìn)一步研究自噬在毛發(fā)生長中的作用及機(jī)制,本研究采用3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)作為自噬通路抑制劑[7],用拔毛法構(gòu)建毛囊再生的模型,以3~4周齡毛囊處于休止期的C57BL/6小鼠作為拔毛后的毛發(fā)再生模型,并以空白處理組和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin,RAPA)組為陰性對照,觀察自噬通路在小鼠毛發(fā)再生中的作用,并進(jìn)一步探討3-MA通過抑制自噬在哺乳動物毛發(fā)再生中的重要意義,為臨床進(jìn)一步研究毛發(fā)疾病的治療手段提供理論基礎(chǔ)。

    1 材 料

    1.1 藥品與試劑

    蘇木精、伊紅(美國Amresco公司);免疫組化試劑盒、DAB濃縮試劑(武漢中杉金橋公司);P62抗體、Beclin1抗體(美國CST公司,兔抗);Western blot用兔抗 LC3B抗體(美國 Sigma公司);鼠抗Ki67抗體(美國 GeneTex公司);FITC-CD34、PECD49f(美國 BD公司);鼠抗 β-actin抗體、HRP標(biāo)記二抗山羊抗兔、HRP標(biāo)記山羊抗鼠、免疫組化用兔抗LC3B抗體(武漢博士德公司);3-甲基腺嘌呤(3-MA)、雷帕霉素(RAPA)(美國 Selleck公司);其他試劑均為市售分析純。

    1.2 儀 器

    Coolpix相機(jī)、DS-Fil熒光顯微鏡(日本 Nikon公司);蛋白質(zhì)凝膠電泳儀、ChemiDocXRSTM凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

    1.3 實(shí)驗動物

    健康雄性3~4周齡 C57BL/6小鼠21只,體重(8±1)g,購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心(合格證號0004285),飼養(yǎng)于(23±2℃,12 h明暗交替)獨(dú)立通氣籠盒SPF系統(tǒng)。所有動物均符合動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

    2 方 法

    2.1 動物分組及處理

    所有鼠隨機(jī)分為3組(n=7),1%戊巴比妥麻醉后,用低熔點(diǎn)石蠟融化后均勻涂抹于小鼠背部,凝固變硬后拔除背部毛發(fā)。3-MA組腹腔注射給予3-MA 2 mg/(kg·d);RAPA組腹腔注射給予 RAPA 1 mg/(kg·d),空白組(Vehicle組)拔毛后不予任何處理;拍照記錄小鼠拔毛區(qū)毛發(fā)生長的動態(tài)變化。14 d后脫頸處死,取拔毛區(qū)全層皮膚組織備用。

    2.2 HE染色檢測毛囊形態(tài)學(xué)改變

    石蠟切片脫蠟水化,蘇木精1~5 min并返藍(lán),伊紅30 s~3 min,雙蒸水徹底清洗,脫水透明,中性樹膠封片,顯微鏡采集圖像并分析數(shù)據(jù)。

    2.3 Western blot印記法檢測皮膚中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

    組織液氮研磨后,細(xì)胞裂解液提取總蛋白并測定含量,SDS-PAGE電泳,80 V電壓跑濃縮膠,100 V電壓跑分離膠,轉(zhuǎn)PVDF膜,5%BSA(溶于TBST)室溫振蕩封閉 1 h。鼠抗 β-actin、兔抗LC3B、兔抗 P62、兔抗 Beclin1一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜,TBST洗膜,二抗(HRP羊抗鼠、羊抗兔1∶3 000)室溫振蕩孵育1 h,TBST洗膜,ECL發(fā)光液顯影,凝膠成像儀采圖,Image Lab5.0軟件分析灰度值。

    2.4 免疫組化檢測毛囊中P62、ki67的表達(dá)

    采用免疫組化SP法。石蠟切片脫蠟水化,檸檬酸修復(fù)液(pH 6.0)微波抗原修復(fù),內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、山羊血清均室溫封閉30 min,兔抗兔抗P62、鼠抗Ki67一抗(1∶200)4℃孵育過夜,二抗山羊抗兔、山羊抗鼠室溫孵育30 min,辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素室溫孵育30 min,DAB(1∶20)顯色,TBS徹底清洗,蘇木精染核返藍(lán),脫水透明,中性樹膠封片,顯微鏡采集圖像并分析數(shù)據(jù)。

    2.5 免疫熒光檢測毛囊中CD34、CD49f的表達(dá)

    冰凍切片復(fù)溫,5%BSA封閉,F(xiàn)ITC-CD34、PECD49f(1∶50)37℃孵育 1 h,DAPI(2μg/mL)室溫30 min,封片,熒光顯微鏡下采集圖像并分析數(shù)據(jù)。

    2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

    3 結(jié) 果

    3.1 3-MA對小鼠背部毛發(fā)生長的影響

    3~4周齡 C57BL/6小鼠毛囊處于休止期[6],在脫毛后即時觀察背部皮膚顏色呈粉紅色,拔毛后,拔發(fā)部位的皮膚顏色開始逐漸變灰、轉(zhuǎn)黑,預(yù)示毛囊開始轉(zhuǎn)入生長期[6]。在拔毛后第 2、5、7、9及14天,記錄小鼠拔毛部位的皮膚顏色變化及毛發(fā)生長,結(jié)果如圖1所示,3-MA組鼠無論皮膚顏色變化還是毛發(fā)生長均明顯快于Vehicle組和RAPA組,而RAPA處理小鼠的背部顏色變化及毛發(fā)生長明顯慢于3-MA組,甚至明顯慢于Vehicle組。在第9天時,3-MA組鼠背部已有明顯新毛發(fā)生長,Vehicle組鼠背雖為灰色但無毛發(fā)生長,而RAPA組鼠背仍為粉色,提示毛囊仍處于休止期。至第14天時,3-MA組和Vehicle組毛發(fā)生長已基本正常,RAPA組雖有毛發(fā)生長,但毛發(fā)數(shù)量和質(zhì)量均明顯較對照組差。

    3.2 3-MA對鼠毛囊再生影響的形態(tài)學(xué)觀察

    第14天時,取鼠背部毛發(fā)再生部位的皮膚全層行HE染色顯示,發(fā)現(xiàn)3-MA組鼠的毛囊生長明顯優(yōu)于 Vehicle組和 RAPA組(圖2-A),表現(xiàn)為:(1)新生毛囊的數(shù)量與密度均明顯多于Vehicle組和RAPA組。每中倍鏡視野(×100)下,3-MA組的毛囊單位計數(shù)顯著增加,與Vehicle組和RAPA組的比較分別為(8.67±1.52)vs(4.67±0.33)和(8.67±1.52)vs(3.33±0.33),P均小于 0.05(圖2-B)。(2)形態(tài)學(xué)上,3-MA組的新生毛囊處于生長期,表現(xiàn)為毛囊長度更長,毛乳頭體積更大,下端深達(dá)脂肪層下部,并接近肌肉深筋膜層淺面;Vehicle組毛乳頭體積偏小,毛乳頭下端多數(shù)僅位于真皮層中下部及脂肪淺層;而RAPA組甚至比Vehicle組毛乳頭更小,毛乳頭下端僅位于真皮層中上部。

    3.3 3-MA對小鼠皮膚中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    Figure1 Effect of3-methyladenine(3-MA)on dorsal hair regrowth in C57BL/6 mice

    為檢測3-MA處理后對C57BL/6鼠再生毛囊中自噬通路的影響,本研究利用Western blot法測定小鼠拔毛部位皮膚中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響。結(jié)果如圖3所示,與Vehicle組相比,3-MA組的Beclin1表達(dá)、LC3BⅡ/Ⅰ比值均顯著降低[分別為(2.72±0.179)vs(4.25±0.084)和(0.28±0.029)vs(0.43±0.069),P均<0.05],總LC3B升高[(16.13±0.213)vs(7.98±0.263)],P62的表達(dá)則明顯升高[(1.25±0.103)vs(0.82±0.013),P<0.05]。而RAPA組的Beclin1表達(dá)、LC3BⅡ/Ⅰ比值顯著較Vehicle組升高[分別為(4.86±0.0.067)vs(4.25±0.084)、(0.81±0.032)vs(0.43±0.069),P均 <0.05],總 LC3B升高[(16.95±0.541)vs(7.98±0.263)],P62的表達(dá)則明顯較 Vehicle組降低[(0.66±0.029)vs(0.82±0.013),P<0.05]。

    Figure2 (A)Effect of 3-MA on hair follicle regeneration by HE staining(×100)and(B)the quantitative result(±s,n=4)RAPA:Rapamycin.*P<0.05 vs vehicle group;#P<0.05 vs3-MA group

    Figure 3 (A)Effect of 3-MA on expressions of Beclin1,P62,LC3BII/Ⅰand LC3B in dorsal skin by Western blot and(B E)the quantitative result(xˉ±s,n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs vehicle group

    但由于以上結(jié)果中,Western blot方法檢測的只是小鼠拔毛部位皮膚全層的蛋白變化,為進(jìn)一步明確該變化是否發(fā)生于再生的毛囊結(jié)構(gòu)中,本研究采用免疫組化染色特異性標(biāo)記再生的毛囊結(jié)構(gòu)中的以上蛋白,證實(shí)變化結(jié)果同上,即在3-MA處理后,在特定的毛囊結(jié)構(gòu)中,LC3B總量明顯升高(3-MA主要通過抑制胞漿型LC3BⅠ型向膜型LC3BⅡ型的轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致LC3BⅠ型堆積[8],LC3B總量增加),P62表達(dá)升高;而在RAPA處理后,LC3B總量升高的同時(RAPA誘導(dǎo)LC3BⅠ型向LC3BⅡ型的轉(zhuǎn)化,LC3BⅡ型表達(dá)增強(qiáng)),P62表達(dá)明顯降低(圖4),表明上述的經(jīng)Western blot檢測的自噬變化結(jié)果同樣發(fā)生于毛囊局部結(jié)構(gòu)中。

    3.4 3-MA對新生毛囊上皮細(xì)胞中Ki67表達(dá)的影響

    為進(jìn)一步明確3-MA導(dǎo)致的自噬變化對毛囊上皮細(xì)胞增殖分化的影響,本研究采用免疫組化染色檢測毛囊上皮細(xì)胞中細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67的表達(dá),結(jié)果如圖5所示。3-MA處理后毛囊上皮細(xì)胞在自噬通路發(fā)生明顯抑制的同時,Ki67的表達(dá)明顯增加,表明細(xì)胞的增殖分裂能力明顯加強(qiáng);而經(jīng)RAPA處理后的結(jié)果卻恰好相反。

    Figure 4 Effect of3-MA on expressions of P62 and LC3B in hair follicle cells by immunohistochemistry(×400)(±s,n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs vehicle group

    Figure 5 Effect of3-MA on expressions of Ki67 in hair follicle cells by IHC(×200)(±s,n=3)*P<0.05,**P<0.001 vs vehicle group

    3.5 3-MA對小鼠毛囊中CD34、CD49f表達(dá)的影響

    為進(jìn)一步探討3-MA對鼠毛發(fā)再生的影響是否與對毛囊干細(xì)胞的作用有關(guān),本研究采用CD34和CD49f雙標(biāo)記染色以顯示毛囊干細(xì)胞[9-10]。結(jié)果如圖6所示,CD34和CD49f雙標(biāo)陽性細(xì)胞主要位于毛囊隆突部,在3-MA處理后雙標(biāo)陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度明顯高于Vehicle組,而RAPA組則明顯低于Vehicle組,表明經(jīng)3-MA處理后,毛囊干細(xì)胞的數(shù)目增多,細(xì)胞增殖活躍,RAPA則可能抑制了毛囊干細(xì)胞的增殖分化過程。

    4 討 論

    哺乳動物毛囊是一種具有自我再生能力的特殊器官,在出生后第一次毛囊形態(tài)學(xué)發(fā)生完成后,就依次進(jìn)入退行期、休止期和生長期的不斷循環(huán)。如果該正常循環(huán)周期一旦被破壞,則會發(fā)生各種毛發(fā)疾病,如臨床休止期脫發(fā)的發(fā)生就與毛囊長期停滯于休止期有關(guān),而如果能快速有效地促進(jìn)毛囊由休止期重新轉(zhuǎn)入生長期,則有助于對休止期脫發(fā)的臨床治療。

    Figure 6 Effect of3-MA on expressions of CD34,CD49f in hair follicle by immunofluorescence(×200)

    自噬是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種重要機(jī)制,恰當(dāng)?shù)淖允伤接兄皶r清除衰老無用的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì),維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定;但過度亢進(jìn)的自噬又可能導(dǎo)致對細(xì)胞內(nèi)容物的過度清除,從而抑制細(xì)胞的功能[11-13]。毛囊作為一種快速更新的器官,維持恰當(dāng)?shù)淖允伤接葹橹匾?。如研究發(fā)現(xiàn),Mnd2鼠在轉(zhuǎn)染HtrA2/Omi基因后,細(xì)胞會出現(xiàn)過度自噬導(dǎo)致鼠的休止期脫發(fā)、體重減輕[14]。Wang等[15]采用自噬抑制劑Tempol和RP67580抑制毛囊細(xì)胞中LC3BⅡ的表達(dá),可以重建毛囊周期循環(huán),而活性氧簇(ROS)和P物質(zhì)則通過誘導(dǎo)毛囊細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),使毛囊處于休止期而不能向生長期轉(zhuǎn)化;在移植自噬相關(guān)基因Atg7缺失小鼠的皮膚至SCID小鼠后,毛乳頭的生成反而增加[16];相反,自噬誘導(dǎo)劑RAPA可增強(qiáng)毛囊細(xì)胞的自噬,從而延長C57BL/6小鼠從休止期進(jìn)入生長期的時間[17]。本研究發(fā)現(xiàn),自噬在毛囊周期的調(diào)節(jié)中的確發(fā)揮著重要作用。同時還發(fā)現(xiàn)在給予自噬抑制劑3-MA刺激后,毛囊上皮細(xì)胞內(nèi)的Beclin1表達(dá)、LC3BⅡ/Ⅰ比值均顯著降低,P62表達(dá)明顯升高,鼠毛囊的再生明顯被促進(jìn),毛囊上皮細(xì)胞中Ki67表達(dá)增加,毛囊干細(xì)胞的增殖分化加速,鼠再生部位的皮膚顏色改變及新發(fā)生成明顯加強(qiáng),而給予RAPA后,Beclin1表達(dá)、LC3BⅡ/Ⅰ比值顯著升高,P62表達(dá)明顯降低,Ki67表達(dá)減少,毛囊干細(xì)胞的增殖減慢,毛囊從休止期入生長期的時間反而延長,且新生毛發(fā)的質(zhì)與量均有下降。證明通過抑制自噬可以促進(jìn)小鼠的毛囊從休止期向生長期的轉(zhuǎn)化,而誘導(dǎo)自噬可能導(dǎo)致休止期的持續(xù)延長。

    綜上所述,本研究提示自噬是毛囊上皮細(xì)胞的一種重要的周期循環(huán)調(diào)節(jié)機(jī)制,自噬的異??赡苁敲野l(fā)生休止期延遲或停滯的原因之一,而通過適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)休止期毛囊的自噬異常,則有助于促進(jìn)毛囊從休止期向生長期的快速轉(zhuǎn)化,促進(jìn)休止期毛發(fā)的再生。使用自噬抑制劑3-MA或其相關(guān)的自噬抑制劑則有望在人類休止期脫發(fā)疾病的治療中發(fā)揮重要作用,具有深入研究的前景與價值。

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