腫瘤壞死因子-α通過誘導上皮間質轉化促進乳頭狀甲狀腺癌細胞的侵襲轉移

呂男男，高蕓，單忠艷

（1. 中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內分泌科，內分泌研究所，沈陽 110001； 2. 沈陽市第四人民醫(yī)院內分泌科，沈陽 110032）

目前，甲狀腺癌已成為全球范圍內患病率上升最快的實體腫瘤，美國1974至2013年間甲狀腺癌發(fā)病率平均每年增加3.6%，主要與乳頭狀甲狀腺癌的增加有關［1］。乳頭狀甲狀腺癌通常分化良好，但伴有侵襲性生長或遠處轉移者5年生存率僅為40%［1-3］。研究［4-5］發(fā)現，上皮間質轉化 （epithelial mesenchymal transition，EMT） 參與多種腫瘤的侵襲與轉移。EMT是上皮細胞失去其極性結構獲得間質細胞特性，進而改變細胞間鏈接狀態(tài)，允許細胞運動的過程。其特征性變化為細胞連接的組分E-鈣黏蛋白表達的缺失，以及間質細胞成分N-鈣黏蛋白的過度表達，從而使細胞獲得移動能力。促炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α），是腫瘤微環(huán)境及自身免疫性疾病中重要的炎癥介質，在許多實體腫瘤及腫瘤微環(huán)境中高表達［6］。TNF-α能否促進乳頭狀甲狀腺癌侵襲轉移目前尚不清楚。因此，本研究擬通過觀察TNF-α對乳頭狀甲狀腺癌細胞系TPC-1增殖和轉移的影響，探討EMT在此過程中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人 重 組TNF-α購 自 美 國Invitrogen公 司；一 抗（E-cadherin，N-cadherin，Vimentin） 購自美國Santa Cruz生物技術公司；乳頭狀甲狀腺癌細胞株TPC-1系美國科羅拉多大學內分泌、糖尿病與代謝病科HAUGEN博士贈予；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國GIBCO公司；transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質膠/基質膜及熒光一抗購自美國BD公司；Alexa Fluor 594標記熒光二抗購自美國Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組：將TPC-1細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清及青霉素 （100 U/mL） 和鏈霉素 （100 μg/mL） 的高糖DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每24 h換液1次。待細胞呈單層貼壁生長，0.25%胰蛋白酶消化傳代。將TPC-1細胞隨機分為TNF-α處理組和對照組，向TNF-α處理組細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為20 ng/mL的TNF-α，36 h后棄除培養(yǎng)液，用于后續(xù)實驗；對照組則不做任何處理。

1.2.2 細胞體外遷移能力實驗：消化TNF-α處理組和對照組細胞，接種至12孔板 （每組6孔），數量以貼壁后鋪滿板底為宜。用10 μL微量加樣器垂直于孔板制造細胞劃痕，盡量保證各劃痕寬度一致。吸去細胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗孔板3次，洗去劃痕產生的細胞碎片。加入無血清培養(yǎng)基，拍照記錄。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱內，每隔4～6 h取出拍照。實驗重復3次。

1.2.3 細胞體外侵襲能力實驗：用50 mg/L的Matrigel膠1∶7稀釋包被transwell小室 （孔徑為8.0 μm） 底部的上室面，用DMEM培養(yǎng)液 （不含10%胎牛血清，含1%牛血清白蛋白） 重懸細胞后制成1×105/mL的細胞懸液，按每室0.5 mL接種于transwell侵襲室的上層，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。取出上層的小室，去除基質膜上未侵襲轉移細胞，HE染色后顯微鏡下隨機取6個高倍 （×400） 視野，計數穿過基質膠的細胞數。實驗重復3次。

1.2.4 實時PCR檢測 E-cadherin， N-cadherin，Vimentin mRNA表達水平：按照Trizol試劑盒 （美國Invitrogen公司） 說明書提取細胞總RNA，應用RNA反轉錄試劑盒 （PrimeScriptTMRT reagent Kit，日本TaKaRa公司）將1 μg總RNA反轉錄為cDNA，反應體系為20 μL。E-cadherin正義引物序列為5'-TGCCCAGAAAATGA AAAAGG-3'，E-cadherin反義引物序列為5'-GTGTAT GTGGCAATGCGTTC-3'；N-cadherin正義引物序列為5'-GAGAACTTTGCCGTTGAAGC-3'，N-cadherin反義引物序列為5'-GTGTATGTGGCAA TGCGTTC3'；Vimentin正義引物序列為5'-GAGAACTTTGCCGTTG AAGC-3'，Vimentin反義引物序列為5'-GCTTCCTGT AGGTGGCAATC-3'；內參照GAPDH正義引物序列為5'-ACCCAGAAGAC TGTGGATGG-3'，GAPDH反義引物序列為5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3'。應用SYBR? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus） 試劑盒 （日本TaKaRa公司），于Light cycle480實時定量PCR儀對反轉錄產物進行擴增。結果應用LightCycler480 1.5軟件進行分析。

1.2.5 Western blotting 檢測 E-cadherin、 N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平：將處于對數生長期的TNF-α處理組和對照組細胞按1×l06/孔接種于6孔板，培養(yǎng)36 h后棄掉培養(yǎng)液，用預冷的PBS洗2次，蛋白裂解液冰上裂解細胞30 min，提取蛋白，BCA法蛋白定量。按每孔50 μg蛋白上樣，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，80 mV恒壓轉膜1～3 h，5%脫脂奶粉封閉l h。加入一抗 （1∶750），4 ℃搖床過夜。漂洗后加入堿磷酸酶標記的二抗 （1∶5 000），孵育1 h。化學發(fā)光，顯影，壓片，灰度掃描。

1.2.6 細胞免疫熒光：在鋪有細胞爬片的6孔板中培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)液中加入終濃度為20 ng/mL的TNF-α處理36 h，待細胞生長融合至95%～100%時，棄除培養(yǎng)液。4%多聚甲醛冰上固定20 min，0.1%TritonX-100覆蓋細胞，室溫靜置5 min，加入1%牛血清白蛋白稀釋的一抗 （E-cadherin 1∶200稀釋，N-cadherin 1∶200稀釋，Vimentin 1∶50稀釋），4 ℃孵育過夜，洗滌，加入PBS稀釋熒光二抗 （1∶400），室溫避光孵育60 min，DAPI覆蓋細胞表面，室溫避光靜置2 min，封片，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 TNF-α處理后乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細胞遷移能力變化

TNF-α （20 ng/mL） 作用36 h后行細胞劃痕實驗，結果顯示，經過24 h爬行，TNF-α處理組TPC-1細胞遷移能力與對照組相比提高了約2倍 （P ＜ 0.01），見圖1。

圖1 TNF-α對TPC-1細胞遷移能力的影響Fig.1 Effect of TNF-α on migration of TPC-1 cells

2.2 TNF-α處理后乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細胞侵襲轉移能力的變化

transwell侵襲實驗結果顯示，TNF-α處理組細胞的侵襲能力較對照組顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01）。見圖2。

2.3 TNF-α對TPC-1細胞EMT標志物mRNA表達

圖2 TNF-α對TPC-1細胞侵襲能力的影響 HE染色×200 Fig.2 Effect of TNF-α on invasion of TPC-1 cells HE×200

水平的影響

實時PCR結果顯示，TNF-α處理后，EMT上皮標志物E-cadherin mRNA表達水平較對照組下降（P ＜ 0.01），TNF-α處理12 h時其表達水平約下降至60%～70%；間質標志物N-cadherin和Vimentin mRNA表達水平升高 （P ＜ 0.01），N-cadherin表達最高增加約2倍，而Vimentin表達上調并不明顯。見圖3。

2.4 TNF-α對TPC-1細胞EMT標志物蛋白表達水平的影響

圖3 TNF-α對TPC-1細胞EMT標志物mRNA表達的影響Fig.3 Effect of TNF-α on the mRNA expression of EMT marker in TPC-1 cells

Western blotting結果顯示，不同濃度TNF-α作用36 h后，TPC-1細胞中E-cadherin蛋白表達水平下調，N-cadherin蛋白表達水平上調。E-cadherin在TNF-α濃度為10 ng/mL時下調幅度最小，約下調10%，20 ng/mL、40 ng/mL分別下調約55%和59%。不同濃度 （10、20、40 ng/mL） TNF-α作用下，N-cadherin上調幅度依次為

1.24、2.26、1.57倍，Vimentin上調幅度依次為1.02、2.12、1.20倍。如圖4所示， 20 ng/mL、 40 ng/mL 濃度 TNF-α處理的細胞與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜0.01）。

2.5 TNF-α處理后TPC-1細胞EMT標志物定位

圖4 TNF-α對TPC-1細胞EMT標志物蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of TNF-α on the protein expression of EMT marker in TPC-1 cells

細胞免疫熒光結果顯示，濃度20 ng/mL TNF-α處理36 h后，TPC-1細胞中N-cadherin主要定位于細胞膜，而E-cadherin和Vimentin主要定位于細胞質，且E-cadherin表達量減少，N-cadherin和Vimentin表達量增加，與Western blotting結果一致。見圖5。

3 討論

EMT是上皮細胞在某些因素的作用下，失去極性及細胞間緊密連接和黏附連接，獲得了浸潤性和游走遷移能力，變成具備間質細胞形態(tài)和特性的細胞的改變，與腫瘤的轉移密切相關。而轉移不僅涉及細胞自身的變化，還和腫瘤微環(huán)境息息相關。腫瘤細胞和（或）腫瘤相關免疫細胞及炎癥細胞都可產生細胞因子，而這些細胞因子可對腫瘤的轉移起直接作用［7-8］。細胞因子TNF-α作為一種重要的炎癥介質，在炎癥、免疫細胞的激活、細胞內穩(wěn)態(tài)、腫瘤進展等方面都發(fā)揮著重要作用。臨床上，與健康人相比，癌前病變和惡性腫瘤患者通常會出現TNF-α血清濃度和組織表達水平升高［9］。事實上，已有研究發(fā)現人類甲狀腺組織可表達編碼炎癥蛋白 的 基 因，如CXCR4，CD44，OPN，CXCL1，CXCL10和SDF-1。甲狀腺腫瘤中激活的原癌基因，如RET/PTC，RAS和BRAF，可以啟動MAPK級聯反應，進而促進細胞自發(fā)的促炎癥轉化。一些細胞因子、趨化因子以及它們的受體表達隨之升高，這其中也包括TNF-α［10-11］。通 過SMAD，NF-κB，AKT/GSK-3β，JAK/STAT等信號通路，長期持續(xù)的小劑量TNF-α刺激也可誘導其它腫瘤的侵襲和轉移［12-13］。

圖5 TNF-α處理后EMT標志物蛋白定位情況 細胞免疫熒光染色 ×200

本研究觀察了促炎性細胞因子TNF-α對乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細胞侵襲轉移能力的影響。結果發(fā)現，TNF-α不僅增強了TPC-1細胞的遷移和侵襲能力，而且在此過程中出現了EMT的標志性變化，即E-cadherin表達下調，N-cadherin和Vimentin表達上調。未經處理的TPC-1細胞中，E-cadherin呈高表達。LIU等［14］的研究表明，E-cadherin表達于分化良好的甲狀腺癌，如乳頭狀甲狀腺癌和濾泡狀甲狀腺癌中，而在未分化甲狀腺癌中則無表達，與本研究結果一致。JENSEN等［15］的研究顯示，在TNF-α刺激下，未分化甲狀腺癌細胞株WRO中E-cadherin表達下調，而除去TNF-α則使E-cadherin的表達恢復。ROCHA等［16］報道分化良好的甲狀腺癌中E-cadherin的下調與不良預后相關。

本研究還觀察了另外2個經典的EMT間質標志物N-cadherin和Vimentin的表達情況，二者的mRNA和蛋白表達水平均在TNF-α刺激后呈現一定程度的上調，但Vimentin的上調幅度較小。E-cadherin的缺失和N-cadherin的增加被稱為“鈣黏蛋白開關”，并在多種實體腫瘤中代表著EMT的發(fā)生［17］。Vimentin是EMT的重要調控因子，同時也在乳頭狀甲狀腺腺癌的EMT中發(fā)揮關鍵作用，它可以獨立誘導EMT［18］。以上研究結果為Vimentin參與乳頭狀甲狀腺癌的惡性進展提供了直接依據。

綜上所述，TNF-α能夠在人乳頭狀甲狀腺癌細胞株TPC-1中誘導EMT，并增強人乳頭狀甲狀腺癌的侵襲轉移能力。