頂空氣相色譜法同時(shí)測(cè)定黃蜀葵花總黃酮提取物中9種有機(jī)溶劑的殘留量

張清華，張治云，楊海霞（山東省藥學(xué)科學(xué)院，濟(jì)南 250101）

黃蜀葵花為錦葵科植物黃蜀葵[Abelmoschus manihot（L.）]的干燥花冠，始載于宋代掌禹錫所著《嘉佑本草》，后歷代本草均有記載?！都斡颖静荨酚涊d黃蜀葵花：“治諸惡瘡、膿水久不痤者，作末敷之即愈，為瘡家要藥”?！侗静菥V目》記載：“其主治小便淋及催生，消癰腫，浸油涂湯火傷”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，黃蜀葵花總黃酮具明顯的抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛、抗病毒及促進(jìn)愈合等藥理作用[1-4]，并可通過抑制心肌脂質(zhì)過氧化、抑制心肌炎癥反應(yīng)，對(duì)缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[5]。

大孔吸附樹脂是一類具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附材料，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、環(huán)保等領(lǐng)域。大孔吸附樹脂多以苯乙烯、二乙烯苯、丙烯酸酯、丙烯腈等為原料制備，經(jīng)過其分離純化的中藥提取物及活性成分可能會(huì)引入苯、甲苯、氯苯、二甲苯等有機(jī)物，因此有必要進(jìn)行相關(guān)殘留物檢測(cè)[6-10]。黃蜀葵花總黃酮是將黃蜀葵花藥材采用乙醇提取濃縮后，經(jīng)過大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，用不同比例的水/乙醇梯度洗脫，并將乙醇洗脫液濃縮干燥所得。在其制備過程中就采用了大孔吸附樹脂進(jìn)行純化。因此，本研究參考國家標(biāo)準(zhǔn)文件（GB/T 24396-2009）[11]和 2015年版《中國藥典》（四部）附錄 0861[12]，以苯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1，2-二氯乙烷、二甲苯、氯苯、苯乙烯、二乙烯苯為檢測(cè)指標(biāo)，采用頂空氣相色譜法測(cè)定了黃蜀葵花總黃酮提取物中的大孔樹脂殘留物，以保證該中藥材提取物的質(zhì)量安全，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

6890N型氣相色譜儀，包括7694E型頂空進(jìn)樣器、氫焰離子化（FID）檢測(cè)器（美國Agilent公司）；XS-205型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-50E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

黃蜀葵花總黃酮提取物[本課題組自制，批號(hào)分別為20091212（初試樣品）和20170115、20170223、20170225（中試樣品）；所用藥材均產(chǎn)自江蘇徐州，每克提取物相當(dāng)于生藥28.6 g]；苯（分析純）、1，2-二氯乙烷（色譜純）、二甲苯（色譜純）、苯乙烯（色譜純）、N-甲基吡咯烷酮（NMP，色譜純）均購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；丙烯腈（化學(xué)純）、氯苯（分析純）、二乙烯苯（化學(xué)純）、甲苯（色譜純）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯乙醚（內(nèi)標(biāo)，色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲基丙烯酸甲酯（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：起始溫度32 ℃，保持6 min，以10℃/min的速率升溫至150℃，再以20℃/min的速率升溫至220℃，保持2 min；FID檢測(cè)器溫度：250℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣為氮?dú)?，流速?.2 mL/min；分流比：10∶1；頂空進(jìn)樣，頂空瓶體積：10 mL，頂空平衡溫度：90 ℃，平衡時(shí)間：45 min；進(jìn)樣量：1 mL。

2.2 溶液制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取苯乙醚100.27 mg，置于50mL量瓶中（事先已加入適量NMP），再加NMP稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.5 mL，置于25 mL量瓶中，加10%NMP水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)貯備液。精密量取該貯備液適量，加10%NMP水溶液稀釋制成苯乙醚質(zhì)量濃度約為4 μg/mL的溶液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液 （1）精密稱取苯10.13 mg、1，2-二氯乙烷10.12 mg、丙烯腈50.27 mg、氯苯50.89 mg、二乙烯苯50.23 mg、甲基丙烯酸甲酯100.75 mg、甲苯100.96 mg、二甲苯100.09 mg、苯乙烯100.26 mg，置于同一50 mL量瓶（事先已加入適量NMP），以NMP稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.5 mL，置于25 mL量瓶中，加10%NMP水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液Ⅰ。（2）分別精密量取對(duì)照品貯備液Ⅰ和“2.2.1”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)貯備液適量，加10%NMP水溶液稀釋制成含苯、1，2-二氯乙烷分別約為0.4 μg/mL，含丙烯腈、氯苯、二乙烯苯分別約為 2 μg/mL，含甲基丙烯酸甲酯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、苯乙醚（內(nèi)標(biāo)）分別約為4 μg/mL的混合溶液，作為對(duì)照品貯備液Ⅱ。（3）取黃蜀葵花總黃酮提取物0.4 g，精密稱定，置于10 mL頂空瓶中，精密加入對(duì)照品貯備液Ⅱ2.0 mL，密封，超聲（功率：50 W，頻率：40 kHz，下同）處理2 min使溶解，輕輕搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液 取黃蜀葵花總黃酮提取物0.4 g，精密稱定，置于10 mL頂空瓶中，精密加入10%NMP水溶液2.0 mL，密封，超聲處理2 min使溶解，輕輕搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取空白溶劑（10%NMP水溶液）和對(duì)照品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液中各待測(cè)成分出峰順序依次為苯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1，2-二氯乙烷、二甲苯（呈現(xiàn)四峰）、氯苯、苯乙烯、苯乙醚、二乙烯苯（呈現(xiàn)四峰），且各待測(cè)峰之間的分離度均大于1.5；空白溶劑對(duì)上述成分檢測(cè)無干擾。色譜圖詳見圖1。

圖1 對(duì)照品溶液和空白溶劑氣相色譜圖Fig 1 GC chromatograms of control solution and blank solvent solution

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液Ⅰ0.2、0.3、0.5、1.0、1.5 mL，分別置于25 mL量瓶中，均精密加入“2.2.1”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)貯備液0.5 mL，以10%NMP水溶液稀釋至刻度，搖勻，制得線性系列對(duì)照品溶液（編號(hào)分別為①②③④⑤）。精密稱取黃蜀葵花總黃酮提取物0.4 g，置于10mL頂空瓶中，平行操作5份，分別精密加入上述線性系列對(duì)照品溶液2 mL，密封，超聲使溶解，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。另同步制備不加對(duì)照品貯備液、只加提取物樣品0.4 g的頂空瓶作為基質(zhì)樣品，同法測(cè)定（以下同）。以對(duì)照品溶液中待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、對(duì)照品溶液中各被測(cè)成分峰面積（需扣除基質(zhì)樣品中對(duì)應(yīng)成分的峰面積，以下同；二甲苯、二乙烯苯均按其4個(gè)峰的峰面積之和計(jì)算）與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of linear relationship test

2.5 定量限和檢測(cè)限考察

精密量取“2.4”項(xiàng)下③號(hào)線性對(duì)照品溶液，以10%NMP水溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。按信噪比10∶1考察定量限，結(jié)果苯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1，2-二氯乙烷、二甲苯、氯苯、苯乙烯、二乙烯苯的定量限分別為0.162 08、0.201 08、0.080 6、0.080 768、0.161 92、0.400 36、0.040 712、0.026 736、0.013 395 μg/mL；按信噪比3∶1考察檢測(cè)限，結(jié)果上述待測(cè)成分的檢測(cè)限分別為0.040 52、0.040 216、0.026 87、0.026 9、0.040 48、0.080 072、0.013 57、0.008 912、0.004 465 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液Ⅰ0.5 mL，置于25 mL量瓶中，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)貯備液0.5 mL，以10%NMP水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液Ⅲ；精密稱取黃蜀葵花總黃酮提取物0.4 g，置于10 mL頂空瓶中，平行操作5份，分別精密加入貯備液Ⅲ2.0 mL，密封，超聲使溶解，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，苯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1，2-二氯乙烷、二甲苯、氯苯、苯乙烯、二乙烯苯峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD分別為0.80%、2.98%、1.63%、2.60%、2.69%、4.92%、2.56%、2.88%、4.42%（n＝5），表明儀器連續(xù)進(jìn)樣精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取黃蜀葵花總黃酮提取物（批號(hào)：20091212）0.4 g，置于10 mL頂空瓶中，共6份，分別精密加入“2.2.1”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)溶液2.0 mL，密封，超聲使溶解，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各待測(cè)成分含量。結(jié)果，樣品中甲基丙烯酸甲酯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯平均含量分別為0.000 032%、0.000 015%、0.000 009%、0.000 053%（RSD分別為3.95%、2.84%、3.42%、2.51%，n＝6），而苯、丙烯腈、甲苯、1，2-二氯乙烷、氯苯則均未檢出。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液Ⅰ0.4、0.5、0.6 mL，置于25 mL量瓶中，分別精密加入“2.2.1”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)貯備液0.5 mL，以10%NMP水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為80%、100%、120%回收對(duì)照品溶液。取9支10 mL頂空瓶（編號(hào)為1～9），分別加入已測(cè)得各組分含量的黃蜀葵花總黃酮提取物（批號(hào)：20091212）0.4 g；1～3號(hào)頂空瓶均分別加入80%回收對(duì)照品溶液2 mL，4～6號(hào)頂空瓶均分別加入100%回收對(duì)照品溶液2 mL，7～9號(hào)頂空瓶均分別加入120%回收對(duì)照品溶液2 mL，超聲使溶解，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算苯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1，2-二氯乙烷、二甲苯、氯苯、苯乙烯、二乙烯苯的含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果，上述待測(cè)成分的平均回收率分別為101.76%、99.41%、99.71%、104.12%、111.27%、105.70%、102.95%、102.61%、101.72%（RSD分別為2.88%、3.27%、1.21%、3.57%、8.16%、5.37%、2.97%、3.09%、4.50%，n＝9），表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.9 黃蜀葵花總黃酮提取物樣品中殘留溶劑含量測(cè)定

取3批黃蜀葵花總黃酮提取物中試樣品（批號(hào)：20170115、20170223、20170225）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.7”項(xiàng)下方法測(cè)定9種殘留溶劑含量。結(jié)果，3批樣品中均未檢出上述殘留溶劑。

3 討論

黃蜀葵花總黃酮提取物在水中的溶解性較差，本研究采用10%NMP水溶液為溶劑，可較好地溶解樣品。筆者曾在預(yù)試驗(yàn)中嘗試采用二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、水、NMP、10%NMP水溶液溶解提取物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水不能完全溶解提取物，而二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺均會(huì)對(duì)被測(cè)組分產(chǎn)生干擾；NMP雖能較好地溶解提取物，但會(huì)導(dǎo)致苯和1，2-二氯乙烷的響應(yīng)值偏低，不能滿足檢測(cè)需求；采用10%NMP水溶液作為溶劑時(shí)，不僅能較好地溶解提取物，對(duì)各被測(cè)組分也無干擾，而且苯和1，2-二氯乙烷的響應(yīng)值明顯提高。

本課題組采用頂空氣相色譜法同時(shí)測(cè)定黃蜀葵花總黃酮提取物中的苯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1，2-二氯乙烷、二甲苯、氯苯、苯乙烯、二乙烯苯等9種有機(jī)溶劑的含量。經(jīng)前期優(yōu)化色譜條件后，采用程序升溫法能實(shí)現(xiàn)各待測(cè)成分的良好分離。其中，二甲苯、二乙烯苯均為其鄰、間、對(duì)二甲苯/二乙烯苯等異構(gòu)體的混合物[12]，導(dǎo)致色譜圖上均呈現(xiàn)四峰現(xiàn)象，故均以4個(gè)峰的峰面積之和計(jì)算對(duì)應(yīng)成分總峰面積。

在本研究過程中發(fā)現(xiàn)，采用頂空進(jìn)樣法時(shí)，供試樣品的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)回收率試驗(yàn)結(jié)果影響較大，如果不在對(duì)照品溶液中加入黃蜀葵花總黃酮提取物，則所得各待測(cè)組分回收率明顯偏低。為了消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，本課題組采用標(biāo)準(zhǔn)加入法[12]進(jìn)行回收率試驗(yàn)，在對(duì)照品溶液中加入與樣品溶液相同量的黃蜀葵花總黃酮提取物，使對(duì)照品和供試樣品處于相同的基質(zhì)環(huán)境下，結(jié)果顯示，各待測(cè)組分回收率均良好，符合相關(guān)規(guī)定。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，可用于黃蜀葵花總黃酮提取物中9種有機(jī)溶劑殘留量的測(cè)定。