經(jīng)溶劑回收儀再生的二甲苯在快速冷凍病理中的染色效果研究

薛曉偉　李星奇　王德田*

經(jīng)溶劑回收儀再生的二甲苯在快速冷凍病理中的染色效果研究

薛曉偉①李星奇①王德田①*

目的：對使用CBG BIOTECH溶劑回收儀再生的二甲苯與新開封二甲苯在手術快速冷凍病理中的染色效果進行比較。方法：選取40例測試病理組織，OCT包埋后制作冷凍切片2張，分別使用再生和新開封二甲苯進行染色處理，就其染色后的組織結(jié)構、細胞核及細胞質(zhì)的染色情況進行評分。結(jié)果：在快速冷凍病理中再生二甲苯與新開封的二甲苯在組織結(jié)構細胞核染色以及細胞質(zhì)染色評分相比，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.38，t=1.45，t=1.32；P＞0.05)。結(jié)論：再生的二甲苯可以應用于快速冷凍病理的HE染色法染色。

二甲苯；回收；HE染色法；快速冷凍病理；CBG BIOTECH溶劑回收儀

[First-author’s address] Department of Pathology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100730, China.二甲苯為無色透明液體，具有一定的毒性，但因其價格低廉，透明效果好，是病理科常用的試劑之一[1-2]。由于脫水透明的過程中不可避免地存在液體攜帶與損耗，為保證染色質(zhì)量，需要根據(jù)切片的負荷量等因素定期更換二甲苯，由此在廢液處理過程中會對環(huán)境造成二次污染[3]。因此，實現(xiàn)二甲苯重復回收使用，不僅可有效地節(jié)約購買試劑的成本更重要的是保護環(huán)境，避免試劑的二次污染。然而，經(jīng)回收后重復利用的二甲苯其應用效果是否能滿足病理診斷的需要仍需加以考證[4-5]。尤其是再生二甲苯在術中快速冷凍病理中的應用效果尚未進行評價，故本研究對再生二甲苯與新開封二甲苯在術中快速冷凍病理中的染色效果進行比較。

1　材料與方法

1.1標本采集

收集2015年6-10月北京協(xié)和醫(yī)院冷凍病理術后未經(jīng)固定的40例患者手術標本，包括乳腺、肺、甲狀腺、腎臟、膽囊以及子宮標本。標本類型涉及乳腺纖維腺瘤、乳腺腺病、肺腺癌、甲狀腺腺瘤、腎透明細胞癌和腎囊腫、膽囊息肉及子宮肌瘤等，測試組織的來源及數(shù)量如表1所示。

表1　測試組織的來源及數(shù)量

將40例病理測試組織經(jīng)OCT包埋后，冷凍切片機切成6～8 μm的切片2張，固定后分別使用再生二甲苯組和新開封二甲苯組進行染色。所有測試標本均為術中快速病理診斷完成后不影響冰余常規(guī)診斷的剩余組織，制作成1 cm×1 cm×0.3 cm的組織塊，避免脂肪及壞死組織。

1.2儀器及試劑

采用CM3050 S冷凍切片機(德國，徠卡)；CBG BIDTECH立式溶劑回收儀(美國)；Aperio數(shù)字病理掃描儀與分析系統(tǒng)(德國，徠卡)；AX10共覽顯微鏡(德國，蔡司)。試劑采用冷凍包埋劑OCT(德國，徠卡)；冷凍固定液、蘇木素染液、伊紅染液、分化液以及返藍液(北京九州柏林生物有限公司)；無水乙醇，新開封二甲苯(國藥集團)。

1.3回收二甲苯

開啟回收儀的電源并抽吸10 L廢二甲苯至處理桶內(nèi)→選擇程序“處理二甲苯(XYLENEMODE)”→進行再生→回收后的二甲苯會流入接收瓶內(nèi)，廢液入廢液桶。

1.4二甲苯純度測定

使用CBG BIOTECH醫(yī)用酒精二甲苯立式回收儀的測試程序?qū)λ厥盏亩妆竭M行純度測試。在100 ml的量筒中加入85 ml的再生二甲苯，后加入去離子水補齊至100 ml，蓋好量筒的蓋子倒轉(zhuǎn)混合物，至分離點液面平穩(wěn)后讀數(shù)a。已再生二甲苯的純度計算為公式1：

1.5染色流程及評分

(1)切片經(jīng)冷凍固定液固定—自來水沖洗—蘇木素染色—自來水洗—分化—返藍—伊紅染色—自來水洗—梯度酒精脫水——分別使用再生二甲苯和新開封二甲苯進行透明—中性樹膠封片。

(2)采用隨機數(shù)字表分法在病理診斷醫(yī)師庫里抽取2名醫(yī)師就組織結(jié)構染色、細胞質(zhì)的染色及細胞核的染色等3方面對切片的染色質(zhì)量進行單盲評分，得分范圍為0～3分：①0分，染色無法滿足診斷的需要；②1分，染色基本能滿足診斷的需要，但是效果較差；③2分，染色能夠滿足診斷的需要，效果一般；④3分，染色能夠滿足診斷的需要，效果較好[6]。

1.6統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計，計數(shù)資料以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，對評分進行t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1再生二甲苯純度

根據(jù)二甲苯與水不相溶的特點，在測試量筒讀取二甲苯與水的分離點，運用純度公式(1)計算出再生二甲苯的純度穩(wěn)定在99.2%～99.5%之間，表明再生的二甲苯純度基本與新開封二甲苯的純度相似。

2.2染色效果

使用再生二甲苯和新開封二甲苯對測試組織冷凍切片進行透明染色，肉眼觀測染色效果，再生二甲苯使用HE染色法染色同樣可以獲得與新開封二甲苯一樣的效果，即切片組織完整，厚薄均勻，核漿分明，符合優(yōu)良片的標準[7-8]，如圖1所示。

圖1　新開封和再生二甲苯透明的冷凍切片HE染色圖(×100)

2.3染色評分

隨機抽取的病理醫(yī)師就2種處理的切片打分結(jié)果顯示，快速冷凍病理中再生二甲苯與新開封的二甲苯在組織結(jié)構、細胞核染色以及細胞質(zhì)染色評分上相比均無明顯統(tǒng)計學差異(t=1.38，t=1.45，t=1.32；P＞0.05)，見表2。

表2　HE染色的評分情況比較

表2　HE染色的評分情況比較

組織結(jié)構得分細胞核得分細胞質(zhì)得分新開封二甲苯2.36±0.292.48±0.282.50±0.29再生二甲苯2.37±0.312.49±0.312.44±0.31 t值1.381.451.32 P值0.780.820.20

3　討論

目前，術中快速病理診斷主要應用冷凍切片，其質(zhì)量的好壞直接影響著手術方案的確定。因此，冷凍切片的HE染色法染色比常規(guī)石蠟切片具有更為苛刻的要求。

二甲苯作為冷凍切片染色過程中的透明試劑，切片在進入二甲苯前，其水分已經(jīng)完全被無水乙醇所替代，若二甲苯中含水，極易被組織吸收，封片時出現(xiàn)中性樹膠與水不相容的現(xiàn)象，導致組織“發(fā)霧”，影響切片質(zhì)量[9-11]。為保證冷凍切片的質(zhì)量，常常需要對二甲苯進行更換，除此之外，病理科在常規(guī)組織處理過程中也會產(chǎn)生大量的廢棄二甲苯液體，以往處理該廢液時，采取直接倒入廢液專道，或者交于環(huán)保部門集中處理，但是大多數(shù)情況下，這些有機溶劑會被焚燒或填埋，這樣廢溶劑不但得不到利用，還可能進入土壤以及大氣，造成環(huán)境二次污染。如何有效的處理這些廢棄液體，目前尚無國家或產(chǎn)業(yè)的統(tǒng)一規(guī)定，多數(shù)地區(qū)采取將病理科實驗室產(chǎn)生的廢棄液體按種類交由有資質(zhì)的廢液回收公司進行回收利用，這一做法雖然有效，但無形中增加了廢液循環(huán)過程中的經(jīng)濟成本[12]。因此，回收儀的出現(xiàn)可實現(xiàn)廢液的就地回收利用，有效地節(jié)約了處置廢液的成本，實現(xiàn)資源的可持續(xù)利用。

病理科產(chǎn)生的廢棄二甲苯中的主要雜質(zhì)是乙醇和石蠟，根據(jù)二甲苯沸點(137～140 ℃)與乙醇沸點(78.4 ℃)不同，設定加熱溫度，進行加熱，使低沸點組分蒸發(fā)，再冷凝以分離廢液組分，即可回收到清潔二甲苯溶劑。

本研究在冷凍切片的HE染色過程中使用再生二甲苯，進行染色測試實驗，切片染色評分也與傳統(tǒng)二甲苯評分無顯著的統(tǒng)計學差異[13-14]；再生二甲苯可以重新應用于術中快速冰凍病理的HE染色。同時，二甲苯的回收效率能夠達到90%以上，依次計算每年可以節(jié)約大量的二甲苯購置成本。

[1]van Maldegem F，de Wit M，Morsink F，et al. Effects of processing delay， formalin fixation，and immunohistochemistry on RNA Recovery From Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Sections[J].Diagn Mol Pathol，2008，17(1)：51-58.

[2]Titford ME，Horenstein MG.Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical pathology[J].Arch pathol lab med，2005，129(4)：502-506.

[3]Buesa RJ.Histology safety：now and then[J]. Ann Diagn Pathol 2007，11：334-339.

[4]Falkeholm L，Grant CA，Magnusson A，et al. Xylene-free method for histological reparation：A multicentre evaluation[J].Lab Invest 2001，81：1213-1221.

[5]Hipolito RN.Xylene poisoning in laboratory workers：vase reports and discussion[J].Lab Med，1980，11：593-595.

[6]薛曉偉，王德田，李星奇.Infinity HE高清恒染系統(tǒng)在病理常規(guī)染色中的應用[J].臨床與實驗病理學雜志，2014，29(9)：1072-1073.

[7]Moelans CB，ter Hoeve N，van Ginkel JW，et al. Formaldehyde substitute fixatives. Analysis of macroscopy，morphologic analysis，and immunohistochemical analysis[J].Am J Clin Pathol，2011，136(4)：548-556.

[8]Ananthaneni A，Namala S，Guduru VS，et al. Efficacy of 1.5% dish washing solution and 95% lemon water in substituting perilous xylene as a deparaffinizing agent for routine h and e staining procedure：a short study[J]. Scientifica，2014(7)：307-310.

[9]Tian F，Wu Z，Yan Y，et al.Synthesis of Visible-Light-Responsive Cu and N-Codoped AC/TiO Photocatalyst Through Microwave Irradiation[J].Nanoscale Res Lett，2016，11(1)：292.

[10]王德田，董建強，梁智勇.實用現(xiàn)代病理學技術[M].北京：北京協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2012：61-62.

[11]丁偉，王德田，董建強，等.簡明病理學技術[M].杭州：浙江科學技術出版社，2014：13-14.

[12]董建強，田玉旺.病理技術學科的規(guī)范化與質(zhì)量控制[J].診斷病理學雜志，2013，20(12)：737-739.

[13]Metgud R，Astekar MS，Soni A，et al. Conventional xylene and xylene-free methods for routine histopathological preparation of tissue sections[J].Biotech Histochem，2013，88(5)：235-241.

[14]Buesa RJ，Peshkov MV.Histology without xylene[J].Ann Diagn pathol，2009，13(4)：246-256.

The assessment of histomorphologic stain effect of recyled xylene for surgical frozen pathology

XUE Xiao-wei, LI Xing-qi, WANG De-tian// China Medical Equipment, 2016,13(11):136-138.

Objective: To investigate the quality of tissue morphology of fast frozen sections between the recycled xylene and the new xylene. Methods: Forty fresh specimens were embedded by OCT and were prepared into two equal sequence sections. With recycled xylene and new xylene stain processing, the haematoxylin and eosin (HE)-stained sections were evaluated for tissue structure, cellular and nuclear detail. Results: There were no significant differences in tissue morphology between recycled and new xylene, including tissue structure (t=1.38, P=0.78), nuclear (t=1.45, P=0.82) and cytoplasm (t=1.32, P=0.20) detail. Conclusion: Recycled xylene is suitable for HE staining in routine fast frozen sections.

Xylene; Recovery; Hematoxylin eosin staining; Fast frozen sections; CBG BIOTECH solvent recycler

薛曉偉,女,(1984- ),碩士，技師。中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院病理科，從事病理技術工作。

1672-8270(2016)11-0136-03

R361

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.11.039

①中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院病理科 北京 100730

xiehewangdetian@126.com

2016-07-22