HPLC法同時測定大黃藥材中8個非蒽醌類成分的含量Δ

陸文瑾，竇志華，曹瑞，倪麗麗，戴瑩（1.宜興市第二人民醫(yī)院藥劑科，江蘇宜興214221；2.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南通 226006；.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 21002）

大黃為蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatumL.）或唐古特大黃（Rheum tanguticumMaxim.et Balf.）或藥用大黃（Rheum officinaleBail.）的干燥根和根莖[1]，是世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用的中草藥之一[2-3]。我國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中的800多個中成藥處方中均含有大黃，故其質(zhì)量的優(yōu)劣可影響用藥的有效性和安全性[4-5]。2015年全國范圍內(nèi)的抽檢結(jié)果顯示，目前市場上流通的大黃藥材合格率僅約為80%，其檢驗項目包括性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、土大黃苷檢查、總灰分檢查、游離型蒽醌類成分含量測定等[6]。大黃中含有蒽醌類及蒽酮類、鞣質(zhì)類、二苯乙烯類、苯丁酮類等非蒽醌類成分[7]，但部分研究僅以大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素和大黃素甲醚等蒽醌類成分作為評價大黃質(zhì)量的指標(biāo)，存在一定的局限性[8]，而大黃中含有的非蒽醌類成分也同樣具有一定的藥理作用[9]。如蒽酮類成分瀉下作用最強[10]，收斂止血作用主要為鞣質(zhì)類成分[11]，二苯乙烯苷類成分具有抗氧化、抗腫瘤、保肝、調(diào)脂、預(yù)防并治療動脈粥樣硬化作用[12]，苯丁酮苷類是大黃中具有活性的一類重要化合物[13]。2015年版《中國藥典》（一部）[1]僅對大黃藥材中5個游離型蒽醌類成分的含量作出規(guī)定：不得少于0.20%，其酸解后的總蒽醌含量不得少于1.5%；《歐洲藥典》（9.0版）[14]也僅規(guī)定了總蒽醌含量不得少于2.2%。鑒于對單一組分的檢測尚無法全面評價大黃的質(zhì)量，因此增加非蒽醌類成分的含量測定對大黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善具有重要意義[15]。

本課題組前期建立了22批大黃藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并在280 nm波長處得到了41個共有峰，通過外標(biāo)法測定了5個游離型蒽醌和總蒽醌的含量，通過一測多評法測定了8個結(jié)合型蒽醌的含量[16]。在此基礎(chǔ)上，本研究建立了同時測定大黃藥材中沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷等8個非蒽醌類成分含量的HPLC法，旨在為建立更全面的大黃質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Alliance e2695型HPLC儀，包括e2695型分離單元、2998型二極管陣列檢測器、Empower 3色譜工作站（美國Waters公司）；SK5200H型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；BT 25S型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

沒食子酸對照品（批號：150226，純度：≥98%）、兒茶素對照品（批號：141224，純度：≥98%）、表兒茶素對照品（批號：140730，純度：≥98%）、表兒茶素沒食子酸酯對照品（批號：140923，純度：≥98%）、番瀉苷A對照品（批號：CHB170508，純度：≥98%）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司；白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷對照品（批號：38963-95-0，純度：98%）、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷對照品（批號：92834097-0，純度：98%）、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷（批號：950184-00-6，純度：98%）均購自上海一林生物科技有限公司；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 藥材

22批大黃藥材中S2、S18、S22為中國食品藥品檢定研究院標(biāo)準(zhǔn)藥材粉末，S21購自南通三越中藥飲片有限公司，其余藥材樣品均由南通市食品藥品監(jiān)督中心葛建華主任中藥師饋贈。除標(biāo)準(zhǔn)藥材外，其余19批均由葛建華主任中藥師鑒定為蓼科植物掌葉大黃（R.palmatumL.）或唐古特大黃（R.tanguticumMaxim.et Balf.）或藥用大黃（R.officinaleBail.）的干燥根和根莖。除標(biāo)準(zhǔn)藥材粉末，其余藥材均粉碎成粉末，過四號篩，備用。大黃藥材來源見表1。

表1 大黃藥材來源Tab 1 Source of Rheum palmatum

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，5%A→30%A；10～40 min，30%A→60%A；40～60 min，60%A；60～70 min，60%A→100%A；70～80 min，100%A）；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：30 μL。在該色譜條件下，分離度均大于1.5，理論板數(shù)以沒食子酸計均不低于8 000，空白對照對測定無干擾，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取樣品粉末約0.15 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇24 mL，超聲（功率：200 W，頻率：53 kHz）處理30 min，冷卻后，加甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取兒茶素對照品9.35 mg、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷對照品4.6 mg，分別置于2 mL量瓶中；另取沒食子酸對照品6.16 mg、表兒茶素沒食子酸酯對照品4.16 mg、番瀉苷A對照品8.04 mg、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷對照品5.45mg、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷對照品11.72 mg，分別置于5 mL量瓶中；另取表兒茶素對照品5.09 mg，置于10 mL量瓶中；分別加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得各單一對照品貯備液。分別精密量取上述沒食子酸對照品貯備液、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷對照品貯備液各0.5 mL，白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷對照品貯備液0.7 mL，兒茶素對照品貯備液0.8 mL，表兒茶素沒食子酸酯對照品貯備液、番瀉苷A對照品貯備液各1.0 mL，4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷對照品貯備液1.25mL，表兒茶素對照品貯備液1.5 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷質(zhì)量濃度分別為0.061 6、0.374、0.076 35、0.076 3、0.083 2、0.115、0.160 8、0.293 mg/mL的混合對照品貯備液。精密量取上述混合對照品貯備液1 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷質(zhì)量濃度分別為0.002 464、0.014 96、0.003054、0.003 052、0.003 328、0.004 6、0.006 432、0.011 72 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 空白對照溶液 以甲醇為空白對照。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液2.5、12.5、25 μL及混合對照品貯備液 5、10、20、30、40 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（x，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.4 定量限與檢測限考察

精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，以信噪比10∶1、3∶1分別計算定量限、檢測限。結(jié)果，沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷的定量限分別為 3.48、4.30、6.40、4.40、3.39、2.87、8.40、4.95 ng，檢測限分別為2.32、2.58、2.40、2.64、2.26、1.23、4.20、2.97 ng。

2.5 精密度試驗

取“2.2.2”項下混合對照品貯備液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為1.66%、1.72%、2.27%、1.76%、2.29%、1.81%、2.53%、1.96%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.1”項下供試品溶液（編號：S21）適量，分別于室溫下放置0、3、6、12、18、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為4.84%、4.20%、4.14%、4.72%、4.16%、4.33%、1.36%、1.96%（n＝6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取樣品粉末（編號：S21），共6份，每份約0.15 g，精密稱定，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中8個成分的含量。結(jié)果，沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷的平均含量分別為0.442、4.580、0.060、0.314、1.280、0.377、3.953、1.000 mg/g，RSD分別為1.53%、3.65%、1.23%、2.21%、2.29%、1.47%、2.59%、2.91%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品粉末（編號：S21），共6份，每份約0.075 g，分別加入一定量的各單一對照品貯備液適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.9 耐用性試驗

取樣品粉末（編號：S21）適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件[流動相B不同濃度比例（0.05%磷酸水溶液、0.10%磷酸水溶液、0.15%磷酸水溶液）、不同流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）、不同柱溫（20、25、30 ℃）]進樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中8個成分的含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，該方法能夠滿足試驗要求，耐用性良好。

2.10 樣品含量測定

取22批樣品粉末適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各批樣品中8個成分的含量，結(jié)果見表5。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

3 討論

有研究指出，在280 nm波長處，大黃成分檢出最為全面[17]。鑒于此，本研究在200～800 nm波長范圍內(nèi)對樣品進行了全波長掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8個待測成分在280 nm波長處均有較強吸收，故選擇280 nm作為檢測波長。同時，筆者又考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液兩種流動相體系對待測成分分離情況的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相時的出峰數(shù)目較多，且分離度良好，故選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液作為本研究的流動相。

雖然有研究采用HPLC法同時測定了大黃中2個蒽酮、3個鞣質(zhì)和4個苯丁酮類成分含量[18]，4個苯丁酮類成分含量[19]，2個蒽酮和2個鞣質(zhì)類成分含量[4，20]，1個蒽酮和2個鞣質(zhì)類成分含量[21]以及2個苯丁酮類和1個二苯乙烯類成分的含量[22]，但均未建立鞣質(zhì)類成分表兒茶素和二苯乙烯類成分白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷含量的測定方法。本研究結(jié)果顯示，大黃藥材樣品中這兩個成分的含量較高，分別為0.060～16.700、0.341～16.966 mg/g，因此有必要對其進行定量分析。

表4 耐用性試驗結(jié)果Tab 4 Results of durability tests

表5 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 5 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

含量測定結(jié)果顯示，22批大黃藥材中8個成分含量存在較大差異，S1、S2、S21中8個成分的含量相對較低，而S3、S4、S14、S17含量相對較高，其含量差異可能與藥材原植物的生長年限有關(guān)。本課題組在大黃產(chǎn)區(qū)考察發(fā)現(xiàn)，藥用大黃、掌葉大黃和唐古特大黃的生長年限一般分別為1、3、5年；同一基源、同一產(chǎn)區(qū)的成分含量也會存在較大差異，這可能與其生長環(huán)境如海拔、經(jīng)度、緯度、光照、種子遺傳等有關(guān)[4，23-24]。

綜上所述，本研究所建方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強，可用于同時測定大黃藥材中8個非蒽醌類成分的含量。