2-乙酰基-4-羥基-丁基咪唑?qū)π∈蠹?xì)胞免疫功能的影響

段驍驍，肖倩倩，魏雪濤，郝衛(wèi)東*

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系/食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

焦糖色，又名焦糖、焦糖色素，是糖類物質(zhì)在高溫下脫水、分解、聚合而成的紅褐色或黑褐色混合型化合物，是我國(guó)允許在食品中使用的最重要天然色素之一，其產(chǎn)銷量占到天然色素的80%以上[1-2]，廣泛用于醬油、醋、啤酒、調(diào)味料等食品中。焦糖色按照使用添加劑的不同可分為普通法生產(chǎn)的I類焦糖色，加亞硫酸鹽生產(chǎn)的II類焦糖色，加氨生產(chǎn)的III類焦糖色和亞硫酸氨法生產(chǎn)的IV類焦糖色，其中IV類焦糖色使用率最高，其次為III類。2-乙酰基-4-羥基-丁基咪 唑 (2-Acetyl-4-tetrahydroxy-butylimidazole， THI)是III類焦糖色生產(chǎn)、加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，因其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出免疫毒性而受到廣泛關(guān)注。研究表明，大鼠攝入III類焦糖色后約1/3的有色物質(zhì)被吸收[3]，其經(jīng)口半數(shù)致死劑量(LD50)高于17500mg/kg[4]，長(zhǎng)期攝入可導(dǎo)致大鼠外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)顯著減少，同時(shí)抑制大鼠特異性和非特異性免疫功能[5-8]。Sinkeidam等[5]發(fā)現(xiàn)III類焦糖色對(duì)大鼠免疫系統(tǒng)的影響是由THI導(dǎo)致的，Gobin等[8]進(jìn)一步證實(shí)，單獨(dú)攝入THI可影響多項(xiàng)大鼠免疫功能指標(biāo)，如胸腺淋巴細(xì)胞數(shù)顯著增加，T細(xì)胞增殖能力降低和NK細(xì)胞活性下降等。Gugasyan等[9]發(fā)現(xiàn)單獨(dú)攝入THI可以抑制小鼠的接觸性超敏反應(yīng)，并引起外周血中淋巴細(xì)胞的減少，而補(bǔ)充維生素B6可在不同程度上緩解THI引起的淋巴細(xì)胞減少癥[10-11]，目前尚無(wú)THI遺傳毒性和致癌性的報(bào)道[12]。因THI可導(dǎo)致嚙齒類動(dòng)物出現(xiàn)可逆性的淋巴細(xì)胞減少癥，F(xiàn)AO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFA)將III類焦糖色的每日允許攝入量(acceptable dailyintake，ADI)定為200mg/kg，THI限量25mg/kg。因Maekawa等[13]提出THI在大鼠體內(nèi)的無(wú)可見有害作用水平(noobservedadverseeffectlevel，NOAEL)為20g/kg，歐洲食品安全局(EFSA)據(jù)此將III類焦糖色的ADI下調(diào)為100mg/kg，THI限量10mg/kg。

鑒于焦糖色在我國(guó)食品生產(chǎn)加工過(guò)程中應(yīng)用廣泛，公眾對(duì)焦糖色及其副產(chǎn)物健康風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)注度不斷增加，因此國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)在2017年對(duì)中國(guó)居民膳食焦糖色暴露風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了專項(xiàng)評(píng)估，在該過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，THI相關(guān)的毒理學(xué)資料十分陳舊，研究?jī)?nèi)容有限且研究結(jié)果不一，不能針對(duì)敏感的毒性效應(yīng)終點(diǎn)獲得可靠的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，難以滿足對(duì)其開展健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的需求。為彌補(bǔ)相關(guān)毒理學(xué)資料的空缺，同時(shí)為開展THI健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供毒理學(xué)數(shù)據(jù)，本實(shí)驗(yàn)研究了7d和30d連續(xù)暴露THI對(duì)小鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c雌鼠，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。6～8周齡，體質(zhì)量18～22g，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，溫度20～25℃，相對(duì)濕度40%～70%，12h/12h明暗交替循環(huán)，飼料為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的普通維持飼料，無(wú)菌墊料，飲用水經(jīng)過(guò)濾除菌處理，動(dòng)物自由飲水和攝食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合北京大學(xué)動(dòng)物福利和管理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器

2-乙酰基-4-羥基-丁基咪唑(THI)、1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；流式抗體 anti-mouseCD3FITC、anti-mouseCD4PE/CyTM5、anti-mouseCD8PE/Cyanine7購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀購(gòu)于日本NIHONKOHDEN公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)Beckman公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于德國(guó)Omega公司；低溫高速離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Heraeus公司。

1.3 分組與處理

將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組(超純水組)和THI低、中、高劑量組，每組12只。按染毒周期分為7d和30d實(shí)驗(yàn)組，連續(xù)每天灌胃給藥，灌胃量均按20 μL/g。7d染毒劑量為0、0.5、2.5、12.5mg/kg，30d為0、0.2、0.5、2.5mg/kg。小鼠麻醉后摘除眼球取血，頸椎脫臼處死動(dòng)物，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 外周血白細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 眼球取血于抗凝管內(nèi)，全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)；制備血涂片，瑞氏染液進(jìn)行染色，鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞。

1.4.2 胸腺T細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 分離胸腺于PBS，研磨至單細(xì)胞懸液；細(xì)胞計(jì)數(shù)后轉(zhuǎn)移至5mL流式管中(每管1×106個(gè)細(xì)胞)，PBS洗滌一次(4 ℃、350g/min，離心5min)；棄上清，用100μL流式染色液重懸細(xì)胞沉淀，加入細(xì)胞表面分子抗體CD3、CD4和CD8混合液，混勻后4℃避光孵育30min；孵育結(jié)束，加入2 mL流式染色液洗滌一次(4℃、350g/min離心5 min)；棄上清，樣品用300μL流式染色液重懸，立即采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行T細(xì)胞分類檢測(cè)。

1.4.3 T淋巴細(xì)胞增殖功能測(cè)定 無(wú)菌條件下分離脾臟于 Hanks液，研磨至單細(xì)胞懸液；轉(zhuǎn)移至15mL離心管，Hanks液洗滌一次(350g/min，5min)；棄上清，重懸于2mLRPMI-1640完全培養(yǎng)液中，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(活細(xì)胞應(yīng)在95%以上)，并調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL；每份細(xì)胞懸液分2孔加入24孔板中(1mL/孔)，其中一孔加入50μLConA液(終濃度為5μg/mL)，另一孔作為對(duì)照，培養(yǎng)72h；培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔棄去培養(yǎng)液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT(5mg/mL，50μL/孔)；培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入1mL酸性異丙醇，混勻后分裝到96孔板中，每孔分裝3個(gè)平行樣，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)，結(jié)果以波長(zhǎng)570nm處的光密度值表示。

1.4.4 NK細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前72h將YAC-1細(xì)胞(靶細(xì)胞)傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)中用RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL；無(wú)菌條件下分離小鼠脾臟于Hanks液，研磨至單細(xì)胞懸液；轉(zhuǎn)移至15mL離心管，Hanks液洗滌一次(350g/min，5min)；棄上清，重懸于2mLRPMI-1640完全培養(yǎng)液中，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(活細(xì)胞應(yīng)在95%以上)，并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106/mL；取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100μL加入U(xiǎn)型96孔板中，同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放孔(靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100μL)、靶細(xì)胞最大釋放孔(靶細(xì)胞和5%TritonX-100各100μL)，培養(yǎng)4h；培養(yǎng)結(jié)束后，1500r/min離心5min，每孔吸取上清100μL置于平底96孔板，加入LDH基質(zhì)液100μL，反應(yīng)3min，每孔加入1mol/L的HCl30μL，測(cè)定D(490)值，按下式計(jì)算NK細(xì)胞活性：

1.4.5 T細(xì)胞趨化功能檢測(cè) 無(wú)菌條件分離脾臟于PBS中，研磨至單細(xì)胞懸液，PBS洗滌一次(4℃，350g/min，離心5min)；棄上清，重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×106/mL，加至96孔Transwell趨化小室上室(25μL/孔)，將含不同濃度1-磷酸鞘氨醇(S1P)的相同培養(yǎng)基用于下室(29μL/孔)；培養(yǎng)1h后，收集下室內(nèi)容物于EP管內(nèi)，350g/min離心5min；將細(xì)胞沉淀重懸于流式染色液中，進(jìn)行抗體染色，具體過(guò)程同1.4.2。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)，兩組均數(shù)之間比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)表達(dá)方式為。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 THI對(duì)小鼠體質(zhì)量和臟器質(zhì)量的影響

THI對(duì)BALB/c小鼠體質(zhì)量和臟器質(zhì)量的影響如圖1所示。7d和30dTHI連續(xù)染毒結(jié)束時(shí)，染毒組小鼠體質(zhì)量、肝、胸腺、雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)和淺表淋巴結(jié)(頜下、腋下和腹股溝淋巴結(jié))質(zhì)量與對(duì)照組相比均未出現(xiàn)明顯變化(P＞0.05)，僅連續(xù)染毒30d時(shí)高劑量組(2.5mg/kg)小鼠脾臟質(zhì)量明顯下降(P＜0.05)。

圖1 THI對(duì)小鼠體質(zhì)量和臟器質(zhì)量的影響(n=12)

2.2 THI對(duì)外周血白細(xì)胞數(shù)的影響

THI染毒7d對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的影響如圖2所示。與對(duì)照組相比，THI2.5和12.5mg/kg劑量組白細(xì)胞總數(shù)均明顯降低(P＜0.05)；12.5mg/kg劑量組淋巴細(xì)胞數(shù)明顯降低(P＜0.05)；2.5和12.5mg/kg劑量組淋巴細(xì)胞占白細(xì)胞總數(shù)比值下降(P＜0.05)。

圖2 THI染毒7d對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的影響(n=12)

THI30d染毒小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)變化情況如圖3所示。與對(duì)照組相比，THI0.5和2.5mg/kg組白細(xì)胞總數(shù)明顯降低(P＜0.05)，2.5mg/kg組淋巴細(xì)胞數(shù)顯著下降(P＜0.05)，淋巴細(xì)胞占白細(xì)胞數(shù)比值、單核細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)在各劑量組中未觀察到明顯變化(P＞0.05)。THI染毒7d和30d各組的紅細(xì)胞數(shù)均在正常值范圍內(nèi)。

圖3 THI染毒30d對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)影響(n=12)

2.3 THI對(duì)胸腺T細(xì)胞數(shù)的影響

THI染毒7d小鼠胸腺細(xì)胞數(shù)的變化結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照組相比，12.5mg/kg劑量組胸腺細(xì)胞總數(shù)和T細(xì)胞數(shù)顯著升高(P＜0.05)，0.5和2.5mg/kg劑量組變化不大，T細(xì)胞占胸腺細(xì)胞總數(shù)比例在各組中基本保持一致。T細(xì)胞數(shù)升高主要是由于單陽(yáng)性T細(xì)胞(CD4+和CD8+T細(xì)胞)數(shù)增加所致，2.5和12.5mg/kg劑量組單陽(yáng)性T細(xì)胞數(shù)顯著升高(P＜0.05)，雙陽(yáng)性T細(xì)胞(CD4+CD8+T細(xì)胞)和雙陰性T細(xì)胞(CD4+CD8+T細(xì)胞)數(shù)在各組間差異不明顯，具體見表1。

圖4 THI染毒7d對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞數(shù)的影響(n=12)

表1 THI染毒7d對(duì)T淋巴細(xì)胞不同亞群細(xì)胞數(shù)的影響(×109/L，n=12)

如圖5所示，THI染毒30d，與對(duì)照組相比，2.5 mg/kg組胸腺細(xì)胞數(shù)和T細(xì)胞數(shù)顯著性升高(P＜0.05)。2.5mg/kg組CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞明顯升高(P＜0.05)，0.5mg/kg劑量組CD4+T細(xì)胞數(shù)明顯升高(P＜0.05)，但CD8+T細(xì)胞數(shù)未觀察到明顯變化。見表2。

圖5 THI染毒30d對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞數(shù)的影響(n=12)

表2 THI染毒30d對(duì)T淋巴細(xì)胞不同亞群細(xì)胞數(shù)的影響(×109/L，n=12)

2.4 THI對(duì)T細(xì)胞增殖功能的影響

如圖6所示，與對(duì)照組相比，THI染毒7d僅在12.5mg/kg劑量組表現(xiàn)出對(duì)T細(xì)胞增殖功能的抑制，THI染毒30d，0.5和2.5mg/kg劑量組T細(xì)胞增殖功能均明顯降低(P＜0.05)。

圖6 THI對(duì)小鼠T細(xì)胞增殖功能的影響(n=12)

2.5 THI對(duì)NK細(xì)胞活性的影響

如圖7所示，與對(duì)照組相比，THI染毒7d和30d后，均在2.5mg/kg劑量組觀察到NK細(xì)胞活性明顯降低(P＜0.05)；0.5mg/kg劑量組僅在30d染毒中表現(xiàn)出對(duì)NK細(xì)胞活性的影響(P＜0.05)。

圖7 THI對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響(n=12)

2.6 THI對(duì)T細(xì)胞趨化功能的影響

如圖8所示，THI染毒7d，與對(duì)照組相比，在1 nmol/L的S1P處理組，CD4+T和CD8+T細(xì)胞均在12.5 mg/kg時(shí)出現(xiàn)對(duì)S1P趨化功能的明顯降低(P＜0.05)，CD8+T細(xì)胞在2.5mg/kg劑量組也出現(xiàn)該功能的降低(P＜0.05)。10nmol/L的S1P對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞的趨化誘導(dǎo)作用最為明顯，兩種細(xì)胞在2.5和12.5mg/kg劑量組均出現(xiàn)趨化功能的明顯降低(P＜0.05)；0.5mg/kg劑量組CD8+T細(xì)胞也表現(xiàn)出趨化功能的下降(P＜0.05)。在100nmol/L濃度的S1P處理組，CD4+T細(xì)胞2.5和12.5mg/kg劑量組趨化功能受到抑制(P＜0.05)，而CD8+T細(xì)胞僅在12.5mg/kg劑量組出現(xiàn)趨化功能抑制(P＜0.05)。

圖8 THI染毒7d對(duì)T細(xì)胞趨化功能的影響(n=6)

如圖9所示，在30d染毒實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，1和10nmol/L濃度S1P處理組，0.5和2.5mg/kg劑量組CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的趨化功能均明顯降低(P＜0.05)；100nmol/LS1P濃度處理組，0.5和2.5 mg/kg劑量組CD4+T細(xì)胞趨化功能明顯受到抑制(P＜0.05)，但CD8+T細(xì)胞僅在2.5mg/kg劑量組表現(xiàn)出趨化功能的降低(P＜0.05)，0.5mg/kg劑量組未觀察到該功能的明顯改變。

圖9 THI染毒30d對(duì)T細(xì)胞趨化功能的影響(n=6)

3 討論

THI作為III類焦糖色生產(chǎn)加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)物之一，因其在動(dòng)物體內(nèi)具有免疫毒性而得到廣泛關(guān)注，但有關(guān)THI的毒理學(xué)研究，年代久遠(yuǎn)，資料陳舊，數(shù)據(jù)缺失嚴(yán)重，結(jié)果缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且受限于實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，評(píng)價(jià)內(nèi)容和手段有限，不能針對(duì)敏感的毒性效應(yīng)終點(diǎn)得到可靠的毒理學(xué)數(shù)據(jù)；研究對(duì)象較為單一，多數(shù)亞急性毒性實(shí)驗(yàn)和亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象均為大鼠，以小鼠為受試動(dòng)物開展的相關(guān)研究較少。鑒于我國(guó)對(duì)于開展THI健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的迫切需要，本實(shí)驗(yàn)選用BALB/c雌鼠作為研究對(duì)象，運(yùn)用多種敏感的免疫功能評(píng)價(jià)方法，從多個(gè)方面全面地、系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了THI的對(duì)小鼠免疫功能的影響，包括非特異性免疫功能和特異性免疫功能，初步得到小鼠THI連續(xù)染毒30d的NOAEL水平為0.2mg/kg，對(duì)于開展THI風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要的參考價(jià)值。

因多數(shù)研究指出，THI的免疫毒作用在嚙齒類動(dòng)物中不會(huì)表現(xiàn)出性別差異[13-15]，故本實(shí)驗(yàn)選用單一性別小鼠作為研究對(duì)象。7d染毒實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)置時(shí)，綜合考慮III類焦糖色和THI在人群中的實(shí)際可能暴露水平[我國(guó)III類焦糖色平均攝入量約為33.71mg/(kg·d)，其中THI平均攝入量約為24.12mg/(kg·d)]、JECFA和EFSA對(duì)于III類焦糖色中THI的限量規(guī)定以及對(duì)歷史文獻(xiàn)相關(guān)毒理學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行換算等多個(gè)方面，最終確定劑量梯度為0、0.5、2.5和12.5mg/kg。THI7d染毒的研究結(jié)果顯示，THI表現(xiàn)出劑量反應(yīng)關(guān)系和免疫抑制作用，2.5mg/kg劑量組在多項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)上已出現(xiàn)明顯改變，同時(shí)0.5mg/kg劑量組在部分指標(biāo)上已出現(xiàn)劑量相關(guān)的輕微變化，雖然差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。考慮到THI30d連續(xù)染毒實(shí)驗(yàn)更長(zhǎng)的暴露周期，并以獲得小鼠30d暴露的NOAEL水平為研究目的，故將30d染毒實(shí)驗(yàn)的劑量調(diào)整為0、0.2、0.5和2.5mg/kg。

研究結(jié)果顯示，THI連續(xù)暴露7d和30d均不會(huì)改變小鼠體質(zhì)量、攝食量和飲水量，也不會(huì)影響小鼠胸腺、肝、淺表淋巴結(jié)的質(zhì)量和臟器系數(shù)。因7d染毒實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)THI對(duì)雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)質(zhì)量的影響，故在30d染毒實(shí)驗(yàn)中摘取了小鼠雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)和腋下淋巴結(jié)，但均未在實(shí)驗(yàn)中觀察到THI對(duì)這3類淺表淋巴結(jié)質(zhì)量的影響。但值得注意的是，THI30d染毒在2.5mg/kg劑量組觀察到脾臟質(zhì)量的明顯降低，而7d染毒2.5mg/kg劑量組及更高的12.5mg/kg劑量組均為未觀察到脾臟質(zhì)量的明顯變化。

研究結(jié)果顯示，THI在小鼠體內(nèi)可引起血中白細(xì)胞數(shù)顯著減少和胸腺細(xì)胞數(shù)顯著增加。7d和30d染毒中，紅細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)等均未觀察到明顯變化，淋巴細(xì)胞變化情況與白細(xì)胞一致，且所占比例在各組基本保持不變，可認(rèn)為外周血中白細(xì)胞數(shù)的減少是由于淋巴細(xì)胞數(shù)減少所引起的，而胸腺細(xì)胞總數(shù)的升高是由于T細(xì)胞數(shù)明顯增加導(dǎo)致的。兩次實(shí)驗(yàn)中胸腺細(xì)胞總數(shù)變化情況與T細(xì)胞變化情況均保持一致，且T細(xì)胞占胸腺細(xì)胞總數(shù)比值在各組間基本保持一致。同時(shí)還觀察到THI可對(duì)胸腺T細(xì)胞亞群細(xì)胞數(shù)產(chǎn)生明顯影響。THI染毒7d，2.5和12.5 mg/kg劑量組的單陽(yáng)性T細(xì)胞(CD4+和CD8+)數(shù)均顯著性升高，雙陽(yáng)性(CD4+CD8+)和雙陰性(CD4-D8-)T細(xì)胞數(shù)基本保持不變，而THI30d染毒2.5mg/kg劑量組單陽(yáng)性T細(xì)胞數(shù)也出現(xiàn)明顯升高，0.5mg/kg劑量組僅出現(xiàn)CD4+T細(xì)胞數(shù)的升高，CD8+T細(xì)胞數(shù)未觀察到明顯變化。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示THI可能影響T細(xì)胞陽(yáng)性選擇過(guò)程或影響T細(xì)胞凋亡，但已有研究指出THI不會(huì)改變胸腺中T細(xì)胞凋亡比率[16]，故THI是否作用于T細(xì)胞分化成熟過(guò)程有待進(jìn)一步的研究。

在THI對(duì)免疫功能影響方面，7d染毒僅在12.5 mg/kg劑量組出現(xiàn)T細(xì)胞增殖功能的明顯降低，而30 d染毒的0.5和2.5mg/kg劑量組均出現(xiàn)T細(xì)胞增殖功能受損，兩次實(shí)驗(yàn)脾中T細(xì)胞數(shù)各劑量組與對(duì)照組相比未出現(xiàn)明顯差異，說(shuō)明THI可以抑制單個(gè)T細(xì)胞的增殖功能。THI染毒7d的2.5和12.5mg/kg劑量組出現(xiàn)NK細(xì)胞活性的降低，0.5mg/kg劑量組未觀察到該現(xiàn)象，而30d染毒的0.5和2.5mg/kg均表現(xiàn)出NK細(xì)胞活性的明顯降低。趨化性功能研究中，連續(xù)染毒7d和30d，CD4+和CD8+T細(xì)胞均對(duì)10nmol/L濃度的S1P處理表現(xiàn)出最強(qiáng)的趨化能力，同時(shí)該條件在THI作用下，兩種細(xì)胞趨化功能受損程度最大。7d染毒2.5和12.5mg/kg劑量組CD4+T細(xì)胞在10和100nmol/L S1P濃度處出現(xiàn)趨化功能降低，僅12.5mg/kg劑量組在1nmol/L濃度處理下細(xì)胞出現(xiàn)功能受損，而2.5和12.5mg/kg劑量組的CD8+T細(xì)胞在1和10nmol/LS1P濃度處理?xiàng)l件下均出現(xiàn)趨化功能降低，100nmol/L濃度處理組該細(xì)胞功能的降低僅在12.5mg/kg劑量組出現(xiàn)，說(shuō)明CD8+T細(xì)胞對(duì)低濃度S1P的趨化功能在THI連續(xù)染毒7d條件下更易受到影響，而CD4+T細(xì)胞對(duì)較高濃度S1P的趨化功能改變更易在THI連續(xù)染毒7d條件下出現(xiàn)。30d染毒實(shí)驗(yàn)中，0.5和2.5mg/kg劑量組CD4+T細(xì)胞在3種濃度S1P條件下均出現(xiàn)趨化功能明顯降低，CD8+T在1和10nmol/LS1P濃度處理下出現(xiàn)趨化功能受損，100nmol/LS1P處理下功能的降低僅在2.5mg/kg劑量組出現(xiàn)。研究結(jié)果顯示，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞針對(duì)不同濃度S1P的趨化功能，受到THI染毒劑量和染毒周期的影響，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步開展THI相關(guān)研究時(shí)設(shè)置的染毒劑量、染毒時(shí)間和設(shè)置的S1P濃度條件，合理選擇細(xì)胞類型提供了依據(jù)。

從THI連續(xù)染毒7d和30d實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，THI可以抑制小鼠的細(xì)胞免疫功能，引起血液淋巴細(xì)胞減少，胸腺中單陽(yáng)性T細(xì)胞增加、T細(xì)胞趨化功能受損等。染毒劑量為0.5mg/kg條件下，當(dāng)染毒時(shí)間從7d延長(zhǎng)至30d時(shí)，會(huì)表現(xiàn)出7d染毒實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)的免疫抑制作用，說(shuō)明THI的毒性作用具有劑量和時(shí)間依賴性。在本研究中，THI連續(xù)染毒30d，0.2mg/kg劑量組未出現(xiàn)明顯毒性作用，且有研究表明，略高于0.2mg/kg劑量THI連續(xù)染毒30d不會(huì)引起小鼠胸腺組織病理樣改變[17-19]，可初步認(rèn)為0.2mg/kg是小鼠THI連續(xù)暴露30d的NOAEL水平，但是否是小鼠THI作用的安全劑量，還需要更長(zhǎng)染毒時(shí)間的毒性研究進(jìn)一步確認(rèn)。