胃癌相關(guān)核心基因的生物信息學(xué)分析

陳秀瓊，孟凡橋，熊 華，王雅麗，周洋媚，唐雯華，鄒燕梅*

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤中心，湖北 武漢 430030)

胃癌是最常見的癌癥之一，在癌癥相關(guān)死亡原因中排位第2[1-2]，大多數(shù)胃癌患者僅在疾病晚期才確診，中位生存期小于1年[3]，胃癌確診的金標(biāo)準(zhǔn)是通過內(nèi)鏡或手術(shù)病理活檢，多種血清腫瘤標(biāo)志物如CA199、CA724、CEA、CA125等早已用于胃癌的早期篩查及預(yù)后評(píng)價(jià)[4]，但靈敏度及特異度均欠佳。多個(gè)基因靶點(diǎn)也已被挖掘用于胃癌靶向治療藥物的研發(fā)，如EGFR、VEGFR、HER2等。但由于早診率低、癌細(xì)胞增殖快、分化程度低、侵襲性強(qiáng)，多種檢查及治療手段的聯(lián)合仍未達(dá)到預(yù)想效果。目前，高通量技術(shù)用于數(shù)據(jù)挖掘的運(yùn)用，能有效、快速的篩選出在癌組織與正常組織中顯著差異表達(dá)的基因，并可利用數(shù)據(jù)庫中的臨床資料評(píng)估靶基因的預(yù)后及診斷價(jià)值。因此，在臨床可應(yīng)用于挖掘新的特異性的早期診斷標(biāo)志物，尋找新的治療靶點(diǎn)及預(yù)后評(píng)判生物標(biāo)志物。

本研究運(yùn)用生物信息分析的方法，從GEO數(shù)據(jù)庫下載3個(gè)不同的胃癌組織芯片表達(dá)譜GSE2685、GSE33335、GSE81948，整理芯片數(shù)據(jù)并從數(shù)據(jù)中獲取在胃癌組織及正常組織中顯著差異表達(dá)的基因，對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能注釋及KEGG通路富集分析，篩選出參與胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的差異基因。通過構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-proteininteractionnetwork，PPI)選出核心基因，最后對(duì)核心基因進(jìn)行生存分析，找出可能提示胃癌患者預(yù)后、具有診斷與治療意義的靶基因。

1 材料與方法

1.1 文件下載及處理

從GEO數(shù)據(jù)庫(GeneExpressionOmnibus，GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載胃癌相關(guān)基因表達(dá)譜芯片(編號(hào)為GSE2685、GSE33335、GSE81948)及其相對(duì)應(yīng)的平臺(tái)信息文件(GPL80、GPL5175、GPL6244)，三者包含的樣本量均不低于20例，樣本分類明確，僅包含癌組織與癌旁組織。GSE2685芯片包含8例正常胃組織及22例胃癌組織，GSE33335芯片包含25例正常胃組織及25例胃癌組織，GSE81948芯片包含5例正常胃組織及15例胃癌組織。利用平臺(tái)信息文件將表達(dá)譜芯片中的探針矩陣轉(zhuǎn)換為基因矩陣。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選

利用R語言軟件(https://www.r-project.org/)的Limma包運(yùn)行已處理的基因矩陣文件，設(shè)置差異表達(dá)基因(differentiallyexpressedgenes，DEGs)篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，差異倍數(shù)(foldchange，F(xiàn)C)對(duì)數(shù)值的絕對(duì)值|Log2(FC)|≥2，分別得到3個(gè)芯片譜中正常組織與胃癌組織間差異表達(dá)的所有基因包括上調(diào)基因與下調(diào)基因，并用火山圖體現(xiàn)，用Funrich軟件取三者差異基因的交集，并制作韋恩圖。

1.3 GO功能注釋和KEGG通路富集分析

基因本體分析(geneontologyanalysis，GO)是一種常用于解釋基因和基因產(chǎn)物以及識(shí)別高通量基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)特征生物學(xué)屬性的方法[5]；京都基因與基因組百科全書(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG)是一個(gè)處理基因組、生物途徑、疾病、藥物和化學(xué)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫的集合[6]。在基因功能注釋在線網(wǎng)絡(luò)工具(DatabaseforAnnotationVisualizationand IntegratedDiscovery，DAVID)(https://david.ncifcrf.gov/)中，對(duì)上述所得的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋，包括生物學(xué)過程(biologicalprocess，BP)、細(xì)胞組成(cellular component， CC)、 分 子 功 能 (molecular function，MF)[7]，選取校正后P值小于0.05的GO，同時(shí)也進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，用R軟件對(duì)富集分析的結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

1.4 PPI構(gòu)建

交互基因檢索工具(SearchToolfortheRetrieval ofInteractingGenes，STRING)是一種用于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)相互作用信息的在線工具[8]。將所得的顯著表達(dá)差異基因?qū)隨TRING網(wǎng)絡(luò)在線工具中(http://string-db.org)，設(shè)置置信度閾值大于0.4，運(yùn)行STRING，得到差異基因表達(dá)的PPI，隱藏其中未連接點(diǎn)。將STRING中得到的PPI文件導(dǎo)入Cytoscape軟件中，使用CytoHubba網(wǎng)絡(luò)分析插件篩選核心基因，核心基因表達(dá)的蛋白為具有調(diào)節(jié)生理功能的蛋白。

1.5 核心基因的生存分析

KM數(shù)據(jù)庫使用10461個(gè)癌癥樣本評(píng)估54675個(gè)基因?qū)ι娴挠绊?，包?143個(gè)乳腺癌，1816個(gè)卵巢癌，2437個(gè)肺癌和1065個(gè)胃癌樣本[9]。利用KM數(shù)據(jù)庫(Kaplan-Meierdatabase，KM)對(duì)核心基因進(jìn)行生存分析，將排名前10的核心基因置于KM數(shù)據(jù)庫中，以檢查其基因表達(dá)水平的改變與患者的5年存活率之間的關(guān)聯(lián)。計(jì)算95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)和對(duì)數(shù)秩P值的風(fēng)險(xiǎn)比(hazardratio，HR)并將其可視化。

1.6 核心基因的診斷價(jià)值及相關(guān)性分析

整合所有的胃癌樣本及正常組織，篩選出核心基因在所有樣本中的表達(dá)量，將其分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。將兩組數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad軟件中，通過繪制ROC曲線(ReceiverOperatingCharacteristicCurve，ROC)將結(jié)果進(jìn)行可視化展示，并計(jì)算出核心基因的ROC曲線下面積(AreaUnderCurve，AUC)。AUC＞0.5表示該基因具有良好的診斷價(jià)值。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(Gene ExpressionProfilingInteractiveAnalysis，GEPIA)對(duì)核心基因進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)用r表示，r＞0.4代表兩者具有較高的相關(guān)性，r的絕對(duì)值越大表示相關(guān)性越強(qiáng)，同時(shí)P＜0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因

在R軟件的Limma包中設(shè)置差異基因篩選條件為校正后P值＜0.05，基因表達(dá)差異倍數(shù)為2，得到DEGs有1839個(gè)，上調(diào)基因851個(gè)，下調(diào)基因988個(gè)，來自GSE2685的上調(diào)基因287個(gè)，下調(diào)基因238個(gè)，來自GSE33335的上調(diào)基因104個(gè)，下調(diào)基因165個(gè)，來自GSE81948的上調(diào)基因460個(gè)，下調(diào)基因585個(gè)，見圖1；取交集后，在3個(gè)表達(dá)譜芯片中均有顯著差異表達(dá)的基因有66個(gè)，上調(diào)基因24個(gè)，下調(diào)基因42個(gè)，見圖2。

2.2 差異基因的GO功能注釋

選取校正后P值即FDR＜0.05，富集程度最高的前5條GO功能，結(jié)果顯示：差異基因所富集的功能主要表現(xiàn)在細(xì)胞外空間、細(xì)胞外外泌體、消化、細(xì)胞外基質(zhì)組織、膠原纖維組織。如圖3、表1中可見以細(xì)胞外空間與細(xì)胞外外泌體功能區(qū)富集的基因數(shù)目最多。

2.3 差異基因的KEGG信號(hào)通路富集分析

DAVID在線工具進(jìn)行差異基因KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，按差異基因富集數(shù)目進(jìn)行排序，選取富集程度最高的前9條通路，包括蛋白質(zhì)消化和吸收、胃酸分泌、氮代謝、ECM-受體相互作用、礦物質(zhì)吸收、AGE-RAGE信號(hào)通路等，如圖4。表1中可見差異基因富集程度最高的通路為蛋白質(zhì)消化和吸收與胃酸分泌。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖

圖2 3個(gè)表達(dá)譜芯片取交集的韋恩圖

圖3 差異表達(dá)基因的GO功能注釋圖

圖4 為差異基因的KEGG通路富集分析圖

2.4 PPI構(gòu)建及核心基因

將STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape軟件中，得到的PPI網(wǎng)絡(luò)由48個(gè)基因和186條邊組成，如圖5，圖中節(jié)點(diǎn)為差異基因，節(jié)點(diǎn)之間的邊表示基因之間的聯(lián)系，與節(jié)點(diǎn)相連的邊越多，基因所起的作用越大。CytoHubba網(wǎng)絡(luò)分析插件通過計(jì)算與節(jié)點(diǎn)連接的邊的數(shù)量篩選出核心基因并做出顏色標(biāo)記，顏色越紅，該基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中所起的作用越大，由此得出相關(guān)度最高的前10個(gè)核心基因即 TOP2A、COL1A1、COL1A2、ATP4A、COL3A1、COL6A3、FN1、LUM、SPARC、SST，如表2所示，SST和ATP4A在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)(較正常組織)，TOP2A、COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL6A3、FN1、LUM、SPARC在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)(較正常組織)。10個(gè)核心基因在胃癌組織中表達(dá)的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義即FDR均＜0.05。

表1 胃癌組織中差異表達(dá)基因的GO功能注釋和KEGG富集分析

2.5 核心基因與生存率的關(guān)系

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

篩選出的核心基因在胃癌組織與正常組織的差異表達(dá)顯著，為進(jìn)一步挖掘核心基因與胃癌預(yù)后的關(guān)系，我們將核心基因的表達(dá)分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，利用KM繪圖儀在線工具繪出每個(gè)核心基因與胃癌患者生存率關(guān)系的KM曲線，并計(jì)算出P值、HR，求得95%CI。在10個(gè)核心基因中，僅COL1A1(1556499_s_at等)、FN1(210495_x_at等)的表達(dá)水平與胃癌患者總生存率的關(guān)系具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[COL1A1，HR=1.49，95%CI(1.22， 1.81)，P＜0.05；FN1，HR=1.46，95%CI(1.23，1.74)，P＜0.05)]，如圖6所示。COL1A1及FN1低表達(dá)組的預(yù)后明顯優(yōu)于高表達(dá)組。

表2 胃癌基因芯片中10個(gè)核心基因表達(dá)特點(diǎn)

圖6 生存曲線圖

2.6 核心基因的診斷價(jià)值

當(dāng)AUC＞0.5時(shí)，提示該指標(biāo)具有較好的診斷價(jià)值。利用GraphPad分別計(jì)算核心基因COL1A1與FN1兩者的AUC，得出AUCCOL1A1=0.90，AUCFN1=0.93，如圖7所示，兩者的P值均＜0.01。結(jié)果提示，COL1A1和FN1兩者在胃癌患者與正常人群中的差異表達(dá)具有臨床診斷意義，可用于胃癌患者的診斷及預(yù)后的提示。皮爾遜法相關(guān)系數(shù)分析得出COL1A1與FN1兩者之間的r=0.59，P=0.00，結(jié)果表明兩者具有較高的相關(guān)性，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有協(xié)同作用。

3 討論

近年來，隨著基因芯片技術(shù)的快速發(fā)展，生物信息學(xué)分析越來越多地用于尋找各種癌癥新的治療靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的預(yù)后評(píng)價(jià)和精準(zhǔn)診療[10]。本研究通過分析來自GEO數(shù)據(jù)庫的胃癌基因芯片數(shù)據(jù)表達(dá)譜，獲取胃癌組織與正常組織之間的顯著差異表達(dá)基因，包含的851個(gè)上調(diào)基因與988個(gè)下調(diào)基因說明胃癌發(fā)生發(fā)展是由多個(gè)基因表達(dá)異?；蛞种苹蚴Щ畹囊粋€(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程。

圖7 核心基因的ROC曲線圖

差異基因的GO功能注釋表明差異基因功能主要表現(xiàn)在細(xì)胞外空間、細(xì)胞外外泌體、消化、細(xì)胞外基質(zhì)組織、膠原纖維組織，KEGG富集分析顯示差異基因主要富集在蛋白質(zhì)消化和吸收、胃酸分泌、氮代謝、ECM-受體相互作用、礦物質(zhì)吸收等。由上可見，差異基因富集的通路及功能主要作用于腫瘤微環(huán)境。近年來，隨著對(duì)腫瘤微環(huán)境研究的深入，大量研究結(jié)果表明，腫瘤微環(huán)境是一個(gè)以免疫抑制機(jī)制為主，免疫激活機(jī)制為輔的位點(diǎn)，在腫瘤的免疫治療，治療耐藥，治療敏感性，腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等過程中起著關(guān)鍵作用[11]，操縱腫瘤微環(huán)境中不同的信號(hào)通路或基因靶點(diǎn)可以創(chuàng)造比以往任何時(shí)候都更有效的治療。因此，尋找有效的靶點(diǎn)及通路至關(guān)重要。外泌體是由細(xì)胞分泌的小囊泡，被發(fā)現(xiàn)可介導(dǎo)相鄰或遠(yuǎn)端細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[12-13]，而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞之間信號(hào)傳導(dǎo)的外泌體被稱為腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的外泌體(tumor-derivedexosomes，TDEs)，已有研究表明TDEs通過攜帶不同的miRNA促進(jìn)多種惡性腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，如外泌體介導(dǎo)的miR-105通過提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，外泌介導(dǎo)的miR-25-3p促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的肝肺轉(zhuǎn)移[14-15]，胃癌來源的外泌體通過引起間皮屏障破壞和腹膜纖維化介導(dǎo)腫瘤定向轉(zhuǎn)移[16]，如通過傳遞表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)調(diào)控肝臟微環(huán)境，促進(jìn)胃癌肝轉(zhuǎn)移[17]。有研究表明胃癌患者血清和組織中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECM)通過ECM-受體相互作用誘導(dǎo)ITGB4/FAK/SOX2/HIF-1α信號(hào)通路調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和葡萄糖代謝，對(duì)于預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的治療靶標(biāo)的發(fā)展具有重要意義[18]。這些差異基因富集的GO功能與KEGG通路為胃癌的起始和進(jìn)展的分子機(jī)制提供了深入的見解，尋找操控胃癌發(fā)生發(fā)展的信號(hào)通路及靶點(diǎn)、開發(fā)新的治療策略能為胃癌患者的生存預(yù)后帶來福音。

為進(jìn)一步明確差異基因之間的相互作用關(guān)系，我們通過構(gòu)建差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI，運(yùn)用CytoHubba插件篩選出10個(gè)核心基因，在10個(gè)核心基因中，我們發(fā)現(xiàn)COL1A1、FN1與胃癌患者的預(yù)后明顯相關(guān)。COL1A1又稱I型膠原α1鏈，與I型膠原α2鏈(COL1A2)組成典型的I型膠原，I型膠原存在于大多數(shù)結(jié)締組織和胚胎組織中，是膠原家族的重要成員，是細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分[19-20]。已有研究指出膠原蛋白在胃癌組織中降解水平升高是腫瘤細(xì)胞侵襲周圍組織的關(guān)鍵步驟[21]，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中COL1A1的上調(diào)與胃癌侵襲性顯著相關(guān)，COL1A1的敲除可抑制癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)miRNAlet-7i、miR-129-5p表達(dá)上調(diào)通過靶向下調(diào)COL1A1促進(jìn)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移[22-23]。生存分析提示，COL1A1的表達(dá)在胃癌組織中顯著降低，低表達(dá)組患者預(yù)后較差(P＜0.05)，同時(shí)，ROC分析顯示AUC=0.90，表明COL1A1在胃癌患者的診斷中具有一定的價(jià)值。因此，我們推測(cè)COL1A1可作為胃癌預(yù)后評(píng)價(jià)、診斷、靶向治療研究對(duì)象的靶標(biāo)之一。FN1，又稱fibronectin1，編碼纖連蛋白，一種以血漿中可溶性二聚體形式存在的糖蛋白，以及細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中的二聚體或多聚體形式。纖連蛋白參與細(xì)胞粘附和遷移過程，通過激活MMP2/MMP9通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[24]，有研究結(jié)果指出胃癌組織中FN1蛋白的陽性表達(dá)明顯高于正常組織，尤其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、分期較晚的胃癌患者中，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)miRNA-200c表達(dá)上調(diào)通過靶向下調(diào)FN1促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增值、侵襲、轉(zhuǎn)移[25-26]。AUC=0.93提示FN1對(duì)胃癌患者具有良好的診斷價(jià)值，通過生存分析顯示，與正常胃組織相比，胃癌組織中的FN1明顯降低，F(xiàn)N1低表達(dá)組預(yù)后差(P＜0.05)，Cai等[27]的研究表明，在結(jié)腸癌(CRC)中，低表達(dá)的FN1通過與ITGA5相互作用促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制CRC細(xì)胞的存活、侵襲和遷移。而FN1在胃癌中的抗腫瘤作用仍需進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。皮爾遜相關(guān)系數(shù)R=0.59，表明COL1A1與FN1在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有協(xié)同作用。目前尚無相關(guān)基礎(chǔ)研究對(duì)兩者的協(xié)同作用深入探討，因此，設(shè)計(jì)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究可能帶來新的突破。

綜上，生物信息分析方法可為未來胃癌基因組個(gè)體化診斷和治療提供有力證據(jù)，利用基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析得到的核心基因所富集的功能與通路說明胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因突變、表達(dá)異常導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖的復(fù)雜過程。核心基因COL1A1、FN1在胃癌組織中的表達(dá)與患者預(yù)后明顯相關(guān)，未來我們將進(jìn)行進(jìn)一步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)其作為評(píng)判預(yù)后、分子靶向治療靶標(biāo)的價(jià)值。