白細(xì)胞介素-17過表達(dá)胃癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的成瘤效應(yīng)研究

張智萍，單保恩，宋靜靜，王 浩，劉英姿，陳 偉，高立平，李巧霞*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心，河北石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院臨床生物細(xì)胞室，河北 石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院特檢科，河北 石家莊 050011)

胃癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的最常見原因之一。目前，越來越多的研究表明，胃癌是一種與炎癥密切相關(guān)的惡性腫瘤。而白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)是一種被廣泛研究的炎癥細(xì)胞因子，主要由活化的人記憶CD4+T細(xì)胞分泌，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮作用，參與細(xì)胞的增殖分化、生物因子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)、機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)及腫瘤生長。IL-17及其主要來源細(xì)胞——Th17細(xì)胞最近在腫瘤研究中得到廣泛關(guān)注。文獻(xiàn)報道，在多種人類腫瘤，包括前列腺癌[1]、乳腺癌[2]和胃癌[3]中均已檢測到Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-17的表達(dá)。然而，Th17細(xì)胞和IL-17在腫瘤進(jìn)展中的具體作用仍存在較大爭議。在不同類型腫瘤或不同的機(jī)體免疫背景下，Th17細(xì)胞和IL-17可能發(fā)揮著不同作用。

本課題組前期研究結(jié)果顯示，胃癌患者外周血和腫瘤組織內(nèi)Th17細(xì)胞數(shù)量和IL-17表達(dá)水平顯著增加，并與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度相關(guān)，提示Th17細(xì)胞和IL-17可能在胃癌的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。大量研究結(jié)果表明，腫瘤組織內(nèi)血管、淋巴管的形成對腫瘤的進(jìn)展、侵襲與轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。

本研究利用IL-17真核表達(dá)載體pcDNA3.1-IL-17轉(zhuǎn)染小鼠胃癌細(xì)胞株MFC，過表達(dá)IL-17，建立荷瘤小鼠動物模型，觀察IL-17過表達(dá)后MFC細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的成瘤效應(yīng)，并檢測與血管、淋巴管形成相關(guān)的IL-17、血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial growthfactor，VEGF)和平足蛋白(Podoplanin)的表達(dá)變化，以期探討IL-17在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小鼠胃癌細(xì)胞株MFC，轉(zhuǎn)染IL-17真核表達(dá)載體pcDNA3.1-IL-17后穩(wěn)定表達(dá)IL-17的MFC/IL-17，及對照組細(xì)胞MFC/pcDNA3.1均由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心保存培養(yǎng)。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；PCR引物由上海生工技術(shù)有限公司合成；兔抗鼠VEGF抗體購自PeproTech公司；兔抗鼠IL-17抗體，兔抗鼠CD31抗體購自Bioworld公司；兔抗鼠Podoplanin抗體購自Epitomics公司；羊抗兔熒光二抗購自美國Rockland公司；免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

30只4～5周齡的615小鼠，雌雄各半，購自北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所動物中心，許可證號京動許(字)017。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將MFC細(xì)胞用含10%胎中血清(FCS)、100U/mL青霉素和0.1mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，MFC/pcDNA3.1和MFC/IL-17用含G418(終濃度為100 μg/mL)的篩選培基，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，每隔2～3d用0.25%的胰酶消化后傳代。

1.4 建立荷瘤小鼠動物模型

615小鼠30只，隨機(jī)分為3組，每組10只。將對數(shù)生長期的MFC、MFC/pcDNA3.1和MFC/IL-17細(xì)胞分別制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個/mL。分別按每只200μL注射于小鼠背部皮下。觀察小鼠成瘤時間及皮下腫瘤大小。于接種腫瘤細(xì)胞3周后處死小鼠，剝離移植瘤塊，稱取腫瘤質(zhì)量。一部分腫瘤組織用于提取RNA和蛋白，一部分固定于中性甲醛中，用于免疫組化分析。

1.5 腫瘤組織中IL-17、VEGF和PodoplaninmRNA表達(dá)檢測

Trizol法提取組織總RNA，用Invitrogen公司試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用GoTagGreen MasterMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所使用的引物序列如表1。反應(yīng)條件如下。IL-17：94℃預(yù)變性5min；94℃、30s，59℃、30s、72℃、30s，共循環(huán)31次；72℃延伸7min。VEGF：94℃預(yù)變性5min；94℃、30s，59℃、30s，72℃、30s，共循環(huán)27次；72℃延伸7min。Podoplanin：94℃預(yù)變性5 min；94℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，共循環(huán)27次；72℃延伸7min。β-actin：94℃預(yù)變性5 min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、30s，共循環(huán)31次；72℃延伸7min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μL，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用Gel-proAnalysis3.1軟件掃描，進(jìn)行灰度值分析。以β-actin為內(nèi)參，分析IL-17、VEGF和PodoplaninmRNA的相對表達(dá)量。

表1 PCR引物序列

1.6 腫瘤組織中IL-17、VEGF、Podoplanin蛋白表達(dá)檢測

提取組織總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量測定，參照BCA蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行。Western blot方法檢測IL-17及VEGF、Podoplanin蛋白表達(dá)。100μg蛋白樣品分別加至濃縮膠的上樣孔中，90V恒壓4℃條件下電泳3h。切下分離的蛋白區(qū)帶凝膠，將平衡好的PVDF膜平鋪在凝膠上，4℃條件下在電泳轉(zhuǎn)膜儀中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。取出PVDF膜，用5%脫脂奶粉37℃封閉1h。TBS洗膜3次，每次6min，加入TBS-T稀釋的一抗，4℃孵育過夜。TBS-T洗膜3次，每次10min，加入TBS-T稀釋的紅外熒光標(biāo)記的二抗，37℃反應(yīng)1h，注意避光。TBS-T洗膜3次，每次10min(避光)，用Odyssey雙色紅外熒光掃描系統(tǒng)進(jìn)行成像并進(jìn)行灰度值分析。以GAPDH為內(nèi)參，檢測腫瘤組織內(nèi)IL-17、VEGF、Podoplanin蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 免疫組織化學(xué)染色法檢測腫瘤組織內(nèi)血管形成情況

將腫瘤組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟后進(jìn)行包埋，制備蠟塊，切成3～5μm的薄片。采用SP法進(jìn)行免疫組化染色。二甲苯Ⅰ脫蠟10min，二甲苯Ⅱ脫蠟10 min，無水乙醇Ⅰ 5min，無水乙醇Ⅱ 5min，95%乙醇5min，80%乙醇5min。自來水沖洗3遍、PBS浸泡2次，每次5min。0.01mol/LEDTA緩沖液高壓修復(fù)3min，冷卻后用0.1mol/LPBS泡洗3次，每次5 min。3%甲醇過氧化氫溶液避光修復(fù)20min。PBS浸泡2次，每次5min。加入正常山羊血清，于37℃恒溫箱濕盒中封閉45min。滴加第一抗體，4℃過夜。PBS浸泡2次，每次5min，滴加生物素化第二抗體，37℃孵育30min，PBS浸泡2次，每次5min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃ 孵育30min，PBS浸泡2次，每次5min。DAB顯色3～5min，蒸餾水終止顯色。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核3min，充分水洗，1%鹽酸酒精分化，1%氨水返藍(lán)，晾干，用樹膠封片。

血管判定標(biāo)準(zhǔn)參考WeinderN標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)皮細(xì)胞形成條狀、裂隙狀等孤立結(jié)構(gòu)，棕黃染色或有管腔者按1條血管計數(shù)。低倍光鏡下確定3個微血管高密度區(qū)域(熱點(diǎn))，然后在高倍鏡下分別計數(shù)每個熱點(diǎn)中3個區(qū)域的CD31染色，用于標(biāo)記微血管密度(microvessel density，MVD)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MFC/IL-17細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的致瘤性

接種MFC/IL-17細(xì)胞的小鼠第5～7d時可見皮下結(jié)節(jié)形成，且腫瘤結(jié)節(jié)生長迅速；而接種MFC和MFC/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠第10天左右才見皮下結(jié)節(jié)形成，且腫瘤結(jié)節(jié)生長緩慢。接種細(xì)胞3周后，處死小鼠，稱取腫瘤質(zhì)量，MFC組腫瘤質(zhì)量為(1.726±0.445)g，MFC/pcDNA3.1組為(2.064±0.397)g，MFC/IL-17組為(5.384±0.391)g。MFC/IL-17組小鼠腫瘤質(zhì)量明顯大于MFC和MFC/pcDNA3.1組(P＜0.05)。

2.2 腫瘤組織中IL-17、VEGF和PodoplaninmRNA的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果見圖1，可見MFC/IL-17組小鼠腫瘤組織中IL-17、VEGF、PodoplaninmRNA表達(dá)水平均高于MFC和MFC/pcDNA3.1組(P＜0.05)。

圖1 腫瘤組織中IL-17、VEGF、PodoplaninmRNA的表達(dá)

2.3 腫瘤組織中IL-17、VEGF和Podoplanin蛋白的表達(dá)

Westernblot檢測結(jié)果見圖2，可見MFC/IL-17組小鼠腫瘤組織中IL-17、VEGF、Podoplanin蛋白表達(dá)水平均高于MFC和MFC/pcDNA3.1組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 荷瘤小鼠腫瘤組織中微血管密度的檢測

圖2 腫瘤組織內(nèi)IL-17、VEGF、Podoplanin蛋白的表達(dá)

用抗CD31抗體對腫瘤組織進(jìn)行標(biāo)記，微血管呈條索或裂隙狀。免疫組化檢測結(jié)果見圖3和圖4，顯示腫瘤組織內(nèi)新生的毛細(xì)血管著色，為棕黃色，且MFC/IL-17組小鼠腫瘤組織內(nèi)微血管密度顯著高于MFC和MFC/pcDNA3.1組(P＜0.05)。

圖3 荷瘤小鼠模型腫瘤組織CD31免疫組化染色(×400)

圖4 腫瘤組織內(nèi)微血管密度

3 討論

腫瘤生長在一個包括上皮和間質(zhì)細(xì)胞、血管和淋巴管、炎性細(xì)胞和免疫細(xì)胞在內(nèi)的錯綜復(fù)雜的微環(huán)境中。微環(huán)境的不同，可能對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生不同的影響[4]。為了研究IL-17在組織水平對小鼠胃癌的影響，本部分實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建荷瘤小鼠動物模型，觀察其對腫瘤生長的作用。同時利用RT-PCR、Western blot及免疫組化實(shí)驗(yàn)方法對IL-17在腫瘤組織中對VEGF、Podoplanin及微血管密度的影響進(jìn)行探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染IL-17基因的小鼠腫瘤組織內(nèi)VEGF、PodoplaninmRNA及蛋白的表達(dá)均高于未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，而后兩組的表達(dá)無明顯差異。免疫組化結(jié)果也表明，IL-17過表達(dá)組小鼠腫瘤組織內(nèi)新生血管密度高于未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組。

慢性或復(fù)發(fā)性炎癥在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。全球約15%的癌癥患者是由于病原體感染所致，其中炎癥是慢性感染的主要組成部分。例如前列腺素E2和IL-6作為腫瘤啟動、生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子參與多種炎癥級聯(lián)反應(yīng)。近年來，眾多報道指出，IL-17細(xì)胞因子家族有免疫調(diào)節(jié)功能，尤其是IL-17A參與了炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)[5-8]。然而，IL-17在腫瘤引發(fā)、生長和轉(zhuǎn)移中的作用仍存在很大爭議[9-11]。文獻(xiàn)報道，在小鼠腫瘤形成模型中，使腫瘤細(xì)胞過表達(dá)IL-17，既可以通過增強(qiáng)抗腫瘤免疫抑制腫瘤的進(jìn)展，也可以通過增強(qiáng)炎癥反應(yīng)和血管形成來促進(jìn)腫瘤的生長[12-13]。

為了進(jìn)一步觀察IL-17在整體水平對胃癌發(fā)生發(fā)展的具體作用，本研究通過建立荷瘤小鼠動物模型，觀察IL-17過表達(dá)后MFC細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的成瘤效應(yīng)，結(jié)果顯示，與對照組相比，MFC/IL-17組小鼠成瘤時間較早、腫瘤生長速度較快，提示在此荷瘤小鼠動物模型中IL-17促進(jìn)了小鼠胃癌的進(jìn)展。大量研究證明，促腫瘤因子在腫瘤微環(huán)境中通過誘導(dǎo)VEGF表達(dá)促進(jìn)腫瘤新生血管形成，加速腫瘤生長。為了驗(yàn)證IL-17的促腫瘤作用是否與誘導(dǎo)VEGF表達(dá)和新生血管生成有關(guān)，本研究分別檢測了3組小鼠腫瘤組織內(nèi)VEGFmRNA和蛋白表達(dá)，以及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31的表達(dá)。結(jié)果顯示，MFC/IL-17組小鼠腫瘤組織內(nèi)VEGF和CD31的表達(dá)顯著高于其他兩組。這與文獻(xiàn)報道，IL-17通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞新生，促進(jìn)血管形成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[14]結(jié)果一致。

最近研究顯示，IL-17可能通過促進(jìn)淋巴管形成對非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移發(fā)揮作用[18]。Podoplanin是一個38kDa的粘蛋白，最初在嘌呤霉素誘導(dǎo)的大鼠腎病的足細(xì)胞表面被檢測到[15]，近來發(fā)現(xiàn)它是微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。Podoplanin可能通過重塑腫瘤細(xì)胞骨架的肌動蛋白，提高細(xì)胞的運(yùn)動能力，進(jìn)而在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[16-17]。本研究結(jié)果顯示，MFC/IL-17組小鼠腫瘤組織中Podoplanin mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于其他兩組，提示Podoplanin可能是IL-17促進(jìn)小鼠胃癌進(jìn)展的另一個關(guān)鍵分子。

綜上所述，在荷瘤小鼠整體水平，IL-17可能通過誘導(dǎo)VEGF、Podoplanin和CD31的表達(dá)，促進(jìn)血管和淋巴管形成，加速胃癌進(jìn)展。