文山三七外植體滅菌處理培養(yǎng)研究

單昌蓉 朱金霞 陳麗華

摘要? ? 本試驗以文山三七的成熟種子為試驗材料，用不同濃度的升汞溶液對其進行不同時長的滅菌處理，觀察和篩選適宜的升汞濃度和適宜的滅菌處理時間。結(jié)果表明，用0.01%升汞溶液對帶種皮種子或去種皮種子進行滅菌處理時，適宜的處理時間均為30 min，處理的種子外植體的污染率不高，且能保障不污染種子有一定的發(fā)芽率;用高濃度的升汞溶液處理去種皮的三七種子，對種子的傷害較嚴重，致使不污染的種子發(fā)芽率較低。

關(guān)鍵詞? ? 三七;種子;組織培養(yǎng);外植體

中圖分類號? ? S567.239? ? ? ? 文獻標識碼? ? A? ? ? ? 文章編號? ?1007-5739（2019）01-0066-02

三七（Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen）與人參同屬五加科人參屬植物，為我國特產(chǎn)名貴中藥材，有止血、補血、治療跌打損傷的作用。有研究表明，三七主要以塊根入藥，其塊根中的主要成分為三七總皂甙、三七素、三七黃酮、三七多糖等，具有改善心腦血管疾病、降血糖、降血脂、降血壓、抗血栓、抗衰老、抗休克、抗炎癥、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、增強免疫力等作用[1-2]。我國的這一傳統(tǒng)珍貴藥材三七，因95%左右三七產(chǎn)自云南省文山州，故又稱文山三七。

云南文山三七種植產(chǎn)業(yè)中，因傳統(tǒng)種植優(yōu)質(zhì)種苗缺乏，導(dǎo)致病蟲害嚴重，種植困難，產(chǎn)量低。隨著科技的進步，有學(xué)者嘗試用組織培養(yǎng)方法研究和生產(chǎn)試管優(yōu)質(zhì)種苗，以滿足生產(chǎn)和市場的需要。1978年，中科院昆明植物研究所的鄭光植等[3]用文山三七的莖段、塊根和粗根為起始材料，對其愈傷組織的誘導(dǎo)進行研究，結(jié)果表明，在生長素2，4-D和椰子乳配合使用時，能有效促進莖段和粗根的愈傷組織，而塊根卻較難誘導(dǎo)出愈傷組織。1992年，陳偉榮等[4]用三七的種胚、幼苗、休眠芽、花序4種材料，通過誘導(dǎo)愈傷組織、胚狀體、不定芽等途徑，最終主要從幼嫩花序中成功誘導(dǎo)出逾2 000株試管苗植株，隨后對試管苗植株的再分化、叢芽誘導(dǎo)、壯苗、生根培養(yǎng)等進行了系統(tǒng)的研究探索，為全省三七試管種苗工廠化生產(chǎn)研究打下了基礎(chǔ)。2013年，孫玉琴等[5]用剝除種皮后的文山三七成熟種子，成功誘導(dǎo)出了根、莖、葉等生長表現(xiàn)良好的試管實生苗，初步建立起了文山三七實生苗組培體系。2016年，李? 濤等[6]采用完全試驗法或正交試驗法，以文山三七塊根為外植體，研究得出了文山三七塊根外植體最佳表面消毒方案和最佳愈傷組織誘導(dǎo)、分化生芽、生根等方案。

本試驗以文山三七優(yōu)良品種的成熟種子為外植體，進行外植體消毒滅菌、誘導(dǎo)培養(yǎng)無菌實生苗等研究，擬以此為基礎(chǔ)進一步進行文山三七愈傷組織或叢生芽的誘導(dǎo)、壯苗和生根培養(yǎng)等試驗研究，初步建立了文山三七優(yōu)良品種的無菌實生苗組培體系，以期為文山三七優(yōu)質(zhì)試管種苗的組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)體系研究提供參考。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

試驗材料為當年采集的文山三七優(yōu)良品種的成熟種子，購買于文山壯族苗族自治州馬關(guān)縣文山三七生產(chǎn)基地。采種植株在田間生產(chǎn)健壯、無病且已種植3年。

1.2? ? 試驗設(shè)計

試驗設(shè)3組處理，每組又設(shè)4個時間處理，分別為帶種皮種子處理（A），先用清水振蕩清洗2～3次，再將種子分為4組（10粒/組），分別用0.01%升汞滅菌處理25、30、35、40 min，最后用無菌水振蕩清洗2～3次，每次2～3 min;種子去種皮處理（B），先用清水振蕩清洗2～3次，再將種子分為4組（10粒/組）后，分別用0.01%升汞滅菌處理 25、30、35、40 min，最后用無菌水振蕩清洗2～3次，每次2～3 min;種子去種皮后處理（C），先用清水振蕩清洗2～3次，再將種子分為4組（10粒/組），分別用0.1%升汞滅菌處理15、20、25、30 min，最后用無菌水振蕩清洗2～3次，每次2～3 min。

1.3? ? 試驗方法

1.3.1? ? 培養(yǎng)基的制備。無菌種子誘發(fā)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1 mg/L+白糖30 g/L+瓊脂6 g/L，pH值5.8。培養(yǎng)基配制好后，按每瓶50 mL分裝到培養(yǎng)瓶中，并用耐高溫塑料封口膜封口扎緊，于高壓濕熱滅菌鍋121～125 ℃下滅菌25 min后，干燥備用。

1.3.2? ? 外植體處理及培養(yǎng)。自然條件下三七種子壽命大約為15 d，種子采集后用含水分20%左右的濕沙保存，使種子度過后熟期。將種子帶回實驗室后，選取顆粒飽滿、大小均勻的種子作為試驗材料，對種子進行不同滅菌處理后，于超凈工作臺上接種至上述培養(yǎng)基中，在光照強度1 500 lx、光照時長12 h/d、溫度26 ℃左右的條件下進行初步培養(yǎng)，誘導(dǎo)種子發(fā)芽。以種子污染率作為本次試驗的主要考查指標，以不污染種子的發(fā)芽率作為考查輔助指標。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 不同處理對文山三七不去種皮種子污染率的影響

從表1可以看出，隨著0.01%升汞溶液滅菌處理時間的延長，不去種皮種子的污染率也逐漸降低，最高污染率為80%，最低污染率為20%;而不污染種子的發(fā)芽率則與0.01%升汞的處理時間成負相關(guān)，即0.01%升汞溶液滅菌處理時間越長，不污染種子的發(fā)芽率越低。在處理組A中，當0.01%升汞的滅菌處理時間為30 min時，污染率為60%，不污染種子的發(fā)芽率為50%;而其他處理時間，或者污染率太高，或者不污染種子發(fā)芽率太低。因此，在本處理組中，0.01%升汞溶液滅菌處理30 min是對文山三七不去種皮種子較適宜的滅菌處理時間。