潘倩 章建全 張傳森
甲狀腺功能減退癥發(fā)病率不斷攀升,干細(xì)胞治療甲狀腺功能減退癥的研究備受關(guān)注,選擇適宜的種子細(xì)胞,并將其誘導(dǎo)成甲狀腺濾泡細(xì)胞(thyroid follicular cells,TFCs)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Lin等[1]首次將小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cells,ES)誘導(dǎo)成TFCs。此后,利用促甲狀腺激素、活化素A、胰島素或胰島素樣生長因子-1等誘導(dǎo)ES[2-4],但效果并不顯著。研究熱點(diǎn)繼而轉(zhuǎn)向ES及誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPS)中核轉(zhuǎn)錄因子8(paired box gene 8,PAX8)與甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(thyroid transcription factor 1,TTF1)基因過表達(dá)[5-8]。然而,ES及iPS面臨的倫理爭議勢必限制其臨床應(yīng)用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell,BMSCs)為成體干細(xì)胞,可向內(nèi)胚層分化,具有廣闊臨床應(yīng)用前景。目前利用間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成甲狀腺前體細(xì)胞已經(jīng)有了初步可行性研究[9-11],但均未對分化程度鑒定及分化條件優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)旨在通過甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子TTF1、PAX8及甲狀腺濾泡細(xì)胞標(biāo)志性蛋白分子鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(sodium/iodide cotransporter,NIS)、甲狀腺過氧化物酶(thyroid peroxidase,TPO)、甲狀腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)探索BMSCs向TFCs分化的適宜條件。
1、細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動物:大鼠甲狀腺濾泡細(xì)胞系(FRTL-5細(xì)胞系),購自 American Type Culture Collection(美國模式培養(yǎng)物保藏所,ATCC)。150 g雄性SD大鼠,購于上海第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。
2.細(xì)胞培養(yǎng)試劑及耗材:DF-12培養(yǎng)基(DMEM/F-12 Medium,液體,含15mmol/L HEPES,L-谷氨酰胺,500 ml)(美國Gibco公司);胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)(美國Invitroegn公司);牛促甲狀腺素(thyroid-stimulating hormone,TSH)、胰島素(insulin,來源于牛胰腺)、氫化可的松(hydrocortisone,HC)、生長抑素(somatostatin,SST)、牛轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,TF)(美國SIGMA公司);培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、EP管、離心管等(美國Costar Corning 公司)。
3.免疫熒光試劑:兔單克隆抗體、小鼠單克隆抗體、小鼠單克隆抗體、兔單克隆抗體(英國Abcam公司);兔多克隆抗體(英國Biorbyt公司);山羊抗兔IgG(RED)、山羊抗小鼠IgG(RED)(美國Invitrogen公司)。
4.RT-PCR主要實(shí)驗(yàn)試劑及耗材:總RNA提取試劑(美國Invitroegn公司);第一鏈cDNA合成試劑盒(美國Thermo公司);熒光定量試劑盒(瑞士Roche公司);引物(美國Invitroegn公司);離心管、TIP頭(美國Axygen公司)。
(一)BMSCs向甲狀腺細(xì)胞分化的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)
1.BMSCs的分離、培養(yǎng):取150 g左右雄性SD大鼠,按全骨髓貼壁法分離、純化獲取原代BMSCs,擴(kuò)增至第3代,備用。
2.實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)分為5組:陰性對照組(B組):P3代SD大鼠BMSCs懸液以1×105個/ ml的細(xì)胞密度接種于6孔板,每孔加入3 ml含10%FBS的D/F-12培養(yǎng)基。陽性對照組(T組):FRTL-5細(xì)胞懸液以1×105個/ml的細(xì)胞密度接種于6孔板,每孔加入3 ml 含5%FBS的FRTL-5培養(yǎng)基。共培養(yǎng)組(C組):將P3代SD大鼠BMSCs懸液以1×105個/ml 的細(xì)胞密度接種于6孔板,嵌入Transwells小室。調(diào)節(jié)FRTL-5細(xì)胞密度為1×105個/ml,將 FRTL-5加入Transwells小 室 PET膜上。用含10%FBS的DF-12培養(yǎng)基將Transwells小室內(nèi)外液體均補(bǔ)足為1.5 ml。誘導(dǎo)素組(F組):P3代SD大鼠BMSCs懸液以1×105個/ ml 的細(xì)胞密度接種于6孔板,每孔加入3 ml 含10%FBS的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。隔天全量換液,誘導(dǎo)7 d。共培養(yǎng)+誘導(dǎo)素組(C+F組):將P3代SD大鼠BMSCs用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基重懸,懸液以1×105個/ml的細(xì)胞密度接種于6孔板,嵌入Transwells小室。調(diào)節(jié)FRTL-5細(xì)胞密度為1×105個/ ml,將 FRTL-5加入Transwells小室PET膜上。用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基將Transwells小室內(nèi)外液體均補(bǔ)足為1.5 ml。
(二)誘導(dǎo)分化細(xì)胞的分析及鑒定
1.形態(tài)學(xué)觀察:以FRTL-5作為形態(tài)學(xué)陽性對照組,倒置相差顯微鏡下逐日觀察C+F組、C組和F組中誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
2.細(xì)胞 TTF1、PAX8、NIS、Tg、TPO 表達(dá)蛋白的免疫熒光染色:細(xì)胞免疫熒光染色法檢測經(jīng)不同條件誘導(dǎo)后的細(xì)胞中蛋白標(biāo)志物TTF1、PAX8、NIS、Tg、TPO的表達(dá)。主要步驟包括:BMSCs經(jīng)共培養(yǎng)+誘導(dǎo)素、共培養(yǎng)及誘導(dǎo)素三種不同條件下誘導(dǎo)1周后,消化離心收集細(xì)胞,重懸,接種于鋪有玻片的24孔板,培養(yǎng)1 d。巴氏吸管吸除24孔板中培養(yǎng)液,PBS充分洗滌后,以4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min,PBS洗3遍,取出玻片置于封口膜上,有細(xì)胞的一面向上。滴加0.3%TritonX-100,室溫下15 min透膜;用10%山羊血清室溫封閉30 min。PBS充分洗滌,按照說明書,加入按1 : 100或1 : 50比例稀釋的一抗,4℃濕盒內(nèi)過夜。16 h后PBS洗去一抗,加入1 : 100稀釋的羅丹明標(biāo)記的熒光二抗,避光保存4 h,PBS充分洗滌,以0.5%DAPI處理15 min標(biāo)記細(xì)胞核,PBS充分洗滌后甘油封片,倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光顯示情況。
3.RT-PCR基因轉(zhuǎn)錄分析法檢測不同培養(yǎng)條件下基因 TTF1、PAX8、NIS、Tg、TPO 的表達(dá):具體步驟:(1)mRNA的提??;(2)總RNA濃度的測定;(3)RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;(4)RT-PCR檢測基因表達(dá)情況(反應(yīng)引物序列見表1)。按照Sybr Green試劑盒進(jìn)行操作。
表1 特異性引物核苷酸序列
應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,不同培養(yǎng)條件下基因 TTF1、PAX8、NIS、Tg、TPO RT-PCR 數(shù)據(jù)由表示,多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析(ANOVA),兩組間資料差異比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
1周后倒置顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長情況,發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)較B組略有改變,細(xì)胞表面凸起略少。另外C+F組部分底層細(xì)胞趨向于培養(yǎng)孔邊緣生長,且形態(tài)變化顯著(圖1)。
1.TTF1:C+F組顯示為胞核、胞漿均有表達(dá),以胞核表達(dá)更為明顯。C組顯示為胞核、胞漿均有表達(dá),但較C+F組弱,以胞核為著。F組顯示為僅有胞核表達(dá)(圖2)。
2.PAX8:C+F組顯示為核周及胞漿內(nèi)均有表達(dá),以核周為著。C組顯示為陰性。F組顯示為胞漿內(nèi)有表達(dá)。(圖3)
3.NIS:C+F組顯示為胞漿內(nèi)表達(dá),C組顯示為胞漿內(nèi)表達(dá),F(xiàn)組顯示為胞漿內(nèi)表達(dá),背景有異染(圖4)。
4.TPO:C+F組顯示為胞漿表達(dá)。C組顯示為胞核及胞漿表達(dá)。F組顯示為胞核及胞漿表達(dá)。(圖5)。
5.Tg:C+F組Tg顯示為胞漿表達(dá)。C組Tg顯示為陰性。F組Tg顯示為胞核表達(dá)(圖6)。
將BMSCs經(jīng)共培+誘導(dǎo)素、共培及誘導(dǎo)素三種不同條件下誘導(dǎo)1周后,實(shí)時熒光定量PCR檢測各組中轉(zhuǎn)錄因子TTF1、PAX8及標(biāo)志性蛋白NIS、Tg和TPO mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示,與C+F組比較,B組、C組、F組PAX8(F= 283.07,P< 0.05)、TTF1(F= 73.36,P< 0.05)、TG(F= 134.03,P<0.05)mRNA水平下降(表2)。
圖1 倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)1周時細(xì)胞形態(tài)
圖2 熒光顯微鏡下觀察培養(yǎng)1周后各組細(xì)胞TTF1表達(dá)情況(免疫細(xì)胞熒光染色法)
甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子是一類僅在甲狀腺濾泡細(xì)胞中共同表達(dá)的蛋白質(zhì),與甲狀腺器官胚胎發(fā)育及分化成熟密切相關(guān),甲狀腺祖細(xì)胞的存活及增長依賴于 TTF1、TTF2、PAX8和HEX的共同調(diào)節(jié),因而TTF1、TTF2、PAX8和HEX的聯(lián)合表達(dá)被視為甲狀腺細(xì)胞所特有[12]。其中轉(zhuǎn)錄因子TTF1和PAX8在甲狀腺發(fā)生中至關(guān)重要[13]。2012年Antonica等[5]研究表明PAX8和TTF1在小鼠胚胎干細(xì)胞中的瞬時表達(dá)能夠驅(qū)動其向甲狀腺上皮細(xì)胞譜系的分化,TTF1的超表達(dá)能夠誘導(dǎo)TTF2的表達(dá),即TTFs之間存在相互作用的等級層次網(wǎng)絡(luò),且PAX8及TTF1位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游[7,14-15]。相較于基因過表達(dá)的技術(shù)手段,本實(shí)驗(yàn)通過不同誘導(dǎo)條件對BMSCs進(jìn)行刺激,培養(yǎng)1周后經(jīng)細(xì)胞免疫組化檢測到TTF1及PAX8的不同表達(dá)情況,以共培體系中添加誘導(dǎo)物質(zhì)的條件下TTF1和PAX8的表達(dá)最為顯著。
圖3 免疫細(xì)胞熒光法檢測培養(yǎng)1周后各組細(xì)胞PAX8表達(dá)情況
圖4 免疫細(xì)胞熒光法檢測培養(yǎng)1周后各組細(xì)胞標(biāo)志性蛋白NIS表達(dá)情況
甲狀腺激素的生物合成有賴于甲狀腺濾泡細(xì)胞特有的標(biāo)志性蛋白分子TSHR、NIS、Tg、TPO等蛋白質(zhì)的正常表達(dá)[16-17]。Tg、TPO、TSHR和NIS基因的聯(lián)合表達(dá)為甲狀腺濾泡細(xì)胞特有[18-20]。甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子對TSHR、NIS、Tg、TPO的基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)在甲狀腺生發(fā)及功能的形成及維持中是必不可少的。TTF1調(diào)節(jié)Tg、TPO、TSHR及NIS的基因轉(zhuǎn)錄;TTF2調(diào)控Tg和TPO的基因啟動子;PAX8調(diào)節(jié)Tg、TPO和NIS的基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中,用細(xì)胞免疫熒光法在PAX8和TTF1表達(dá)顯著的共培+誘導(dǎo)素組中檢測到NIS、TPO和Tg的顯著表達(dá);而僅有TTF1表達(dá)的共培組未檢測到Tg的表達(dá);TTF1弱表達(dá)和PAX8表達(dá)的誘導(dǎo)因素組Tg弱表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子PAX8和TTF1不同的表達(dá)情況,可能是致使各實(shí)驗(yàn)組Tg、TPO及NIS表達(dá)不同的關(guān)鍵因素。
圖5 免疫細(xì)胞熒光法檢測培養(yǎng)1周后各組細(xì)胞標(biāo)志性蛋白TPO表達(dá)情況
圖6 免疫細(xì)胞熒光法檢測培養(yǎng)1周后各組細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Tg表達(dá)情況
RT-PCR測定與對照組比較,TPO mRNA水平在共培組中有增高趨勢;NIS mRNA水平在3組中均有增高趨勢;PAX8 mRNA水平在共培+誘導(dǎo)素組、誘導(dǎo)素組中有不同程度增高趨勢;TTF1 mRNA水平在共培+誘導(dǎo)素組、共培組中有不同程度增高趨勢;Tg mRNA水平在共培+誘導(dǎo)素組中有明顯增高趨勢。整體而言,認(rèn)為共培+誘導(dǎo)素組各甲狀腺相關(guān)標(biāo)識蛋白基因的變化趨勢最為理想。
表2 RT-PCR檢測TTF1、PAX8、NIS、Tg、TPO在各組細(xì)胞中的表達(dá)(n = 3,±s)
表2 RT-PCR檢測TTF1、PAX8、NIS、Tg、TPO在各組細(xì)胞中的表達(dá)(n = 3,±s)
注:與 B 組比較,aP < 0.05;與 C+F 組比較,bP < 0.05;與 C組比較,cP < 0.05
分組 TPO NIS PAX8 TTF1 TG B 組 0.07±0.03 0.05±0.01 0.02±0.01 0.03±0.01 0.10±0.05 C+F 組 0.23±0.07 0.55±0.07a 6.21±0.04a 0.33±0.04a 15.00±2.00a C 組 0.40±0.15a 0.60±0.09a 0.54±0.31b 0.15±0.03ab 1.61±0.40b F 組 0.04±0.02c 0.70±0.07ab 3.31±0.30abc 0.08±0.02b 1.91±0.39b F值 12.33 59.12 283.07 73.36 134.03 P 值 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版)2019年2期