心血管前體細(xì)胞誘導(dǎo)、增殖、分化及應(yīng)用研究進(jìn)展

江徐 王永煜

脊椎動(dòng)物的心血管系統(tǒng)主要起源于胚胎發(fā)育過(guò)程的中胚層，其主要表達(dá)Brachyury-T（T），當(dāng)它們轉(zhuǎn)變?yōu)榍靶呐K中胚層時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)中胚層后方同源物1（mesoderm posterior 1，MESP1）和胎肝激酶 1（fetal liver kinase 1，F(xiàn)LK-1），這就是發(fā)育中最早形成的心血管前體細(xì)胞（cardiovascular progenitor cells，CPCs）。當(dāng) MESP1+細(xì)胞離開(kāi)原條時(shí)，MESP1表達(dá)關(guān)閉，在遷移過(guò)程中心臟前體細(xì)胞快速增殖形成前板中胚層和側(cè)板中胚層，成為表達(dá)NK型同源盒基因轉(zhuǎn)錄因子2.5（NK2 transcription factor related，locus 5，Nkx2.5）或 Islet-1轉(zhuǎn)錄因子（islet-1 transcription factor，ISL1）的CPCs[1]。之前報(bào)道在小鼠及人的成體心臟組織中，存在一種c-Kit+CPCs細(xì)胞，能夠自我更新及分化為心肌細(xì)胞（cardiomyocytes，CMs）、內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）和血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs），隨后還發(fā)現(xiàn)其他類(lèi)型的CPCs，包括心肌球源性細(xì)胞、側(cè)群細(xì)胞和心外膜源性細(xì)胞等[2]。然而最新研究證據(jù)顯示，哺乳動(dòng)物成體心臟組織中并不存在可以分化為CMs的內(nèi)源性干細(xì)胞[3-4]。研究表明c-Kit在心臟中的表達(dá)從胚胎到成年逐漸減少，而在胚胎發(fā)育階段，c-Kit+前體細(xì)胞主要存在于神經(jīng)嵴。有研究小組報(bào)道新生鼠的c-Kit+非CMs可以在體外分化為CMs但在成年心臟中均不可分化為CMs。此外，心臟來(lái)源的c-Kit+細(xì)胞在體外分化中，很少上調(diào)心臟標(biāo)志物基因的表達(dá)，而且?guī)缀鯖](méi)法分化為能收縮的CMs。所以，成體c-Kit細(xì)胞似乎與發(fā)育期間觀察到的CPCs群體不相關(guān)，內(nèi)源性c-Kit+譜系細(xì)胞很可能不是成年CMs更新的主要細(xì)胞來(lái)源[5]。此外，多能干細(xì)胞（pluripotent stem cells，PSCs）在體外可定向誘導(dǎo)為CPCs也表達(dá)各種不同的標(biāo)志物。本文將主要圍繞胚胎發(fā)育過(guò)程及體外誘導(dǎo)的CPCs研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、常見(jiàn)的CPCs標(biāo)志物

1.MESP1：研究表明MESP1是最早的CPCs標(biāo)志物之一。哺乳動(dòng)物的心臟發(fā)育始于原腸胚形成期，這時(shí)MESP1表達(dá)在原條的心血管祖細(xì)胞中，并促進(jìn)其特化、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和心血管分化。應(yīng)用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)小鼠胚胎發(fā)育中MESP1+CPCs進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MESP1對(duì)外胚層退出多能性，促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和心血管細(xì)胞特化是必須的。使用Cre重組酶敲除MESP1基因后的譜系追蹤實(shí)驗(yàn)也證明，MESP1+細(xì)胞主要對(duì)羊膜的中胚層成分和心管的心肌有貢獻(xiàn)。然而在小鼠中敲除MESP1基因并不影響CPCs的特化和早期心臟的分化，但會(huì)導(dǎo)致其心臟形態(tài)發(fā)育異常，因此認(rèn)為MESP1對(duì)CPCs的定向遷移和極性影響更大[6]。MESP1+CPCs在分子水平上也存在異質(zhì)性，可能分化為不同類(lèi)型及心臟不同區(qū)域的心血管細(xì)胞[7]。

2.Nkx2.5：雖然MESP1是心臟譜系細(xì)胞的最早標(biāo)志物之一，但其表達(dá)時(shí)間較短，當(dāng)Nkx2.5開(kāi)始表達(dá)時(shí)，MESP1就無(wú)法檢測(cè)到[8]。Wu等[9]分別從小鼠發(fā)育的胚胎和胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）分化過(guò)程中分離出Nkx2.5+細(xì)胞，均可進(jìn)一步分化為CMs和VSMCs。小鼠中的其他譜系追蹤研究也表明，一些心內(nèi)膜細(xì)胞是胚胎Nkx2.5前體細(xì)胞的后代。此外，全基因組轉(zhuǎn)錄分析表明胚胎來(lái)源的Nkx2.5前體細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮標(biāo)志物，這進(jìn)一步說(shuō)明Nkx2.5+細(xì)胞的內(nèi)皮分化能力。果蠅Tinman基因與Nkx2.5是同源基因，當(dāng)Tinman發(fā)生突變時(shí)，果蠅無(wú)法形成心臟，而小鼠Nkx2.5缺陷則可形成心臟，但許多心肌特異基因的表達(dá)減少且心臟形態(tài)發(fā)育異常。這表明Nkx2.5在心臟轉(zhuǎn)錄因子中是高層次的。

3.ISL1：小鼠的譜系追蹤實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，ESCs分化的ISL1+祖細(xì)胞在飼養(yǎng)層短暫擴(kuò)增后可分化成三種心臟譜系細(xì)胞。胚胎發(fā)育過(guò)程ISL1在心臟中胚層中瞬時(shí)表達(dá)，隨著CPCs進(jìn)入分化程序而表達(dá)下調(diào)[10]。少量ISL1+細(xì)胞在人類(lèi)及小鼠新生心臟中仍可檢測(cè)到，成體后就檢測(cè)不到。Nkx2.5+CPCs和ISL1+CPCs是否屬于完全不同的群體或來(lái)自共同祖細(xì)胞仍然有待確定。

4.c-Kit：2003年，Beltrami等[11]研究組從成年小鼠心臟中分離出一種表達(dá)c-Kit的細(xì)胞群，可形成克隆，能夠自我更新，并且能夠分化成CMs、ECs和VSMCs，因此認(rèn)為c-Kit也是CPCs的標(biāo)志物。Nadal-Ginard等[12]利用表達(dá)c-Kit Cre的慢病毒感染Rosa-YFP報(bào)告基因小鼠，對(duì)c-Kit+細(xì)胞進(jìn)行譜系示蹤，發(fā)現(xiàn)心臟損傷后8%的CMs來(lái)源于c-Kit+心肌干細(xì)胞，認(rèn)為c-Kit+細(xì)胞具有在體內(nèi)分化成CMs的能力。然而，一些研究小組難以重復(fù)Anversa團(tuán)隊(duì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為成體心臟c-Kit+細(xì)胞無(wú)法分化形成新的CMs。2014年，van Berlo等[13]采用c-Kit MerCreMer和c-Kit Cre小鼠示蹤c-Kit+細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)c-Kit+細(xì)胞無(wú)論是在心臟發(fā)育還是出生后心臟損傷和衰老過(guò)程中都很少貢獻(xiàn)CMs。2015年，Sultana等[14]也發(fā)現(xiàn)小鼠成年心臟中c-Kit+細(xì)胞并不分化為CMs而是ECs。2016年，Liu等[15]實(shí)驗(yàn)室利用譜系示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)成年小鼠心臟存在c-Kit+CMs，但它們不是由干細(xì)胞分化來(lái)的而是預(yù)先存在表達(dá)c-kit的CMs。他們進(jìn)一步通過(guò)更精確的雙重組酶示蹤技術(shù)明確c-Kit+非CMs，不論是在心臟的生理穩(wěn)態(tài)還是心肌梗死后，都不形成新的CMs[16]。由此可見(jiàn)，c-Kit+的CPCs可能僅存在胚胎發(fā)育階段，而成體心臟中似乎不存在可以分化為CMs的c-Kit+的CPCs。此外，之前認(rèn)為心臟Sca-1+細(xì)胞最近也被證明并非CPCs，無(wú)法分化為新細(xì)胞。

除了上述幾種重要的CPCs標(biāo)志物外，其他可能的CPCs標(biāo)志物還包括：GATA結(jié)合因子4（GATA binding factor 4，GATA4）、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α（platelet-derived growth factor receptor α，PDGFR α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體 2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR 2即Flk1/KDR）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5（insulin-like growth factor binding protein 5，IGFBP 5）、信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白 α（signal regulatory protein α，SIRP α）等。Yoon 等[17]應(yīng)用表面質(zhì)譜分析等方法鑒定了在小鼠Flk1和PDGFR α表達(dá)的CPCs中表達(dá)FZD4的亞群細(xì)胞可以促進(jìn)CMs的分化。另外，也有實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)受體酪氨酸激酶樣孤兒受體 2（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2，ROR2）和CD13 雙標(biāo)記的細(xì)胞可以作為具有心臟中胚層特征的CPCs[18]。在PSCs分化過(guò)程，SIRPα可在Nkx2.5開(kāi)始表達(dá)前表達(dá)在CPCs上，所以SIRPα也可能作為早期CPCs的有用標(biāo)志物，但在體內(nèi)早期發(fā)育中的表達(dá)尚不清楚[19]。這些特定的被認(rèn)為可以作為早期CPCs標(biāo)志物的基因，是否對(duì)CPCs的功能有什么特別的作用還有待進(jìn)一步研究。

二、CPCs的誘導(dǎo)、增殖和分化信號(hào)通路調(diào)節(jié)

1.CPCs誘導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)：心臟發(fā)育是一個(gè)有序的過(guò)程，涉及中胚層，專(zhuān)能CPCs及其分化的心血管細(xì)胞的順序誘導(dǎo)。在體內(nèi)，CPCs誘導(dǎo)過(guò)程受到其鄰近細(xì)胞特別是內(nèi)胚層分泌誘導(dǎo)因子的影響和調(diào)節(jié)，其關(guān)鍵信號(hào)通路和分子在不同物種間是相對(duì)保守的。因此在體外，通過(guò)調(diào)控這些重要的信號(hào)通路，可能從PSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生CPCs群體。然而，由于這些信號(hào)通路性質(zhì)和時(shí)間調(diào)控的復(fù)雜性，不同PSCs細(xì)胞系的分化效率存在著差異。所以，誘導(dǎo)hPSCs分化為CPCs過(guò)程中優(yōu)化這些必要因素是至關(guān)重要的，這樣就能通過(guò)簡(jiǎn)單且可重復(fù)的方法，將hPSCs有效轉(zhuǎn)化成同質(zhì)的CPCs，而不需要進(jìn)行細(xì)胞分選。Noseda等[20]總結(jié)了涉及中胚層形成和隨后心臟模式化過(guò)程中的關(guān)鍵信號(hào)通路，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）和Activin/Nodal通路，Wnt信號(hào)通路及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）通路（圖1）。

圖1 CPCs的作用及調(diào)控

經(jīng)典Wnts和BMPs在誘導(dǎo)早期原始中胚層中發(fā)揮高度保守的作用。Nodal對(duì)小鼠胚胎的位置信息至關(guān)重要，它誘導(dǎo)原腸胚形成。FGF信號(hào)作為中胚層誘導(dǎo)的感受態(tài)因子可能與Nodal的作用相似，并且在CPCs特化中與BMP一起發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)，BMP，Wnt和Nodal都可能在原腸胚形成后或體外干細(xì)胞分化的相應(yīng)階段起抑制心臟分化作用。從MESP1表達(dá)階段顯示BMP和Nodal的抑制可以增加GATA4，Tbx5和SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物亞基Baf60c的表達(dá)，促進(jìn)心源性位點(diǎn)的染色質(zhì)重塑，并引發(fā)細(xì)胞進(jìn)一步向心血管細(xì)胞分化[21]。此外，Cao等[22]還發(fā)現(xiàn)MEK-ERK1/2通路的活化在AA誘導(dǎo)iPSCs衍生的CPCs增殖中起關(guān)鍵作用。他們經(jīng)過(guò)一系列篩選，發(fā)現(xiàn)含有BMP4，AA和GSK3抑制劑CHIR99021的培養(yǎng)基在3 d內(nèi)能快速有效地將未分化的PSCs轉(zhuǎn)化成同質(zhì)CPCs群體。這些結(jié)果表明，BMP4信號(hào)在從PSCs誘導(dǎo)CPCs的過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，而強(qiáng)力激活MEK-ERK1/2通路的AA與GSK3抑制劑進(jìn)一步有效地促進(jìn)了PSCs轉(zhuǎn)變?yōu)镃PCs。

2.調(diào)節(jié)CPCs增殖的信號(hào)：CPCs的擴(kuò)增和譜系定型受多種信號(hào)途徑的復(fù)雜調(diào)節(jié)，主要包括FGF，經(jīng)典Wnt，IGF-PI3K，音猬因子（sonic hedgehog，SHH）[23]。由于第二心區(qū)（second heart field，SHF）祖細(xì)胞能夠不斷分裂，并能較長(zhǎng)時(shí)間維持未分化狀態(tài)，這個(gè)群體成為CPCs增殖研究的重點(diǎn)。

FGF信號(hào)主要通過(guò)誘導(dǎo)ERK磷酸化和PI3K/AKT促進(jìn)CPCs增殖。FGF8和FGF10均在SHF中表達(dá)，對(duì)心臟發(fā)育過(guò)程形態(tài)發(fā)生起著重要作用[24]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路主要通過(guò)調(diào)節(jié)調(diào)控細(xì)胞周期的靶基因，包括上調(diào)c-Myc，Cyclin D和c-jun及下調(diào)p21來(lái)調(diào)節(jié)CPCs增殖。Wnt信號(hào)也可能刺激CPCs內(nèi)的FGF生成和信號(hào)傳導(dǎo)，其中FGF10被證明是直接靶標(biāo)。但是，Wnt/β-catenin信號(hào)的過(guò)度激活可能導(dǎo)致SHF的CPCs的分化，需要非經(jīng)典Wnt配體Wnt5a和Wnt11來(lái)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)從而維持CPCs群體。除了抑制ISL1表達(dá)外，在一些模型中，Wnt/β-catenin信號(hào)也會(huì)下調(diào)其他心臟發(fā)育基因的表達(dá)，包括GATA基因[25]。所以Wnt/ β-catenin信號(hào)對(duì)于CPCs增殖是必需的。

此外，IGF信號(hào)在CPCs增殖中也發(fā)揮作用，應(yīng)用Nkx 2.5 Cre/IGF1R/Insr小鼠條件性敲除心臟中IGF1R，胚胎心肌增殖有明顯的缺陷。而IGF下游分子Akt在細(xì)胞核過(guò)表達(dá)時(shí)能增強(qiáng)CPCs增殖。SHH信號(hào)也可通過(guò)IGF信號(hào)通路PI3K和Akt分子調(diào)節(jié)CPCs增殖。SHH由內(nèi)胚層產(chǎn)生，其信號(hào)傳導(dǎo)活動(dòng)可以在小鼠后SHF觀察到，并且已證明其對(duì)于雞SHF增殖是必需的。增強(qiáng)SHH信號(hào)時(shí)可刺激體外培養(yǎng)SHF外植體的增殖，但在體內(nèi)SHF的增殖反應(yīng)較弱。

PSC-CPCs誘導(dǎo)后似乎并不能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)。Zhang等[26]報(bào)道了通過(guò)抑制BMP、Activin/Nodal和GSK3通路能夠維持hPSC-CPCs在體外增殖超過(guò)15代。Birket等[27]研究組通過(guò)過(guò)表達(dá)myc基因也能夠在IGF-1和HH激動(dòng)劑作用下維持CPCs的增殖。2016年，兩個(gè)研究小組[28]通過(guò)重編程小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)出一類(lèi)可增殖的心血管祖細(xì)胞（induced expandable cardiovascular progenitor cells，ieCPCs），這些ieCPCs分別在不同特定培養(yǎng)條件下可自我更新超過(guò)18代以上，且仍然保留其CPCs原始形態(tài)和基因表達(dá)模式。當(dāng)被注射進(jìn)小鼠心梗心臟內(nèi)時(shí)，能顯著地改善心臟功能。因此，進(jìn)一步優(yōu)化CPCs體外擴(kuò)增的培養(yǎng)條件對(duì)其在心血管疾病細(xì)胞治療中的臨床轉(zhuǎn)化有重要的意義。

3.CPCs分化為心血管細(xì)胞的信號(hào)調(diào)節(jié)：CPCs具有向3 個(gè)主要心血管細(xì)胞譜系高效分化的能力。CPCs經(jīng)增殖形成不同亞型后，在特定位置經(jīng)特定信號(hào)作用將導(dǎo)致終末分化。增殖信號(hào)的減弱可能是誘導(dǎo)分化的關(guān)鍵因素，其中改變FGF和BMP信號(hào)的平衡可能是決定心血管細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵。心外膜和心內(nèi)膜來(lái)源的FGF信號(hào)在心臟發(fā)育過(guò)程可以促進(jìn)CMs增殖，而在去除這些FGF信號(hào)的情況下，CMs的分化將會(huì)過(guò)早發(fā)生。隨著SHF的CPCs接近主心臟管，它們暴露于增加的BMP和非經(jīng)典Wnt信號(hào)，這被認(rèn)為是CMs分化的主要驅(qū)動(dòng)因素。BMP被證明是在CPCs向心肌分化的過(guò)程一直需要的，但在分化中的CMs內(nèi)BMP信號(hào)則被抑制。非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路可能在CMs分化中發(fā)揮積極作用，Wnt11通過(guò)上調(diào)TGF-β2的表達(dá)，已被證明對(duì)于正常心肌分化和流出道形態(tài)發(fā)生是重要的。此外，線粒體活性氧（ROS）也可能參與CMs的分化，因?yàn)樵黾覴OS可導(dǎo)致CMs周期阻滯[29]，而且在hESC分化為CMs的早期ROS也升高。

成年CMs作為終末分化細(xì)胞一直被認(rèn)為不具備再生能力，Wang等[30]的最新研究挑戰(zhàn)了這一經(jīng)典理論，該研究直觀地顯示了缺血性損傷后的成年CMs具備再生能力和收縮功能。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這些終末分化CMs是以“去分化—增殖—再分化”的過(guò)程再生出新的CMs。這一研究揭示“去分化—增殖—再分化”是成年心肌增殖的生物學(xué)特征和心肌內(nèi)源性再生的重要途徑，并探明了心肌再分化的具體分子機(jī)制，為臨床促進(jìn)心肌再生，治療心肌梗死和心力衰竭帶來(lái)曙光。

VEGF被認(rèn)為是ECs分化和增殖的關(guān)鍵因素，可促進(jìn)ESC來(lái)源的ISL1+CPCs向ECs分化。TGF-β，PDGF和視黃酸信號(hào)通路則對(duì)各種祖細(xì)胞分化為SMCs及其增殖十分關(guān)鍵，但其對(duì)CPCs的直接作用尚需深入研究[31]。

三、CPCs在心血管疾病治療中的作用

由于CPCs具有向各種心血管細(xì)胞多向分化的潛能及增殖能力，因此被認(rèn)為是一種比較理想的心血管疾病細(xì)胞治療的種子細(xì)胞，人們已經(jīng)在動(dòng)物模型中嘗試應(yīng)用各種類(lèi)型的CPCs。Liu等[32]移植MESP1+CPCs到小鼠心梗組織中發(fā)現(xiàn)提高了小鼠的存活率并改善了心功能，而且這些細(xì)胞整合到心梗心臟中分化為CMs、ECs和VSMCs。但是近年來(lái)的研究表明，CPCs治療改善心功能的機(jī)制更多的是旁分泌抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)和促血管因子等的作用而不是移植的CPCs整合到損傷的心肌中分化為心血管細(xì)胞。例如Zhu等[33]應(yīng)用hESCs來(lái)源的CPCs結(jié)合使用免疫抑制劑治療非靈長(zhǎng)類(lèi)心梗模型，發(fā)現(xiàn)28 d時(shí)，多種免疫抑制劑的使用促進(jìn)CPCs的存活，同時(shí)CPCs治療減少心梗CMs的凋亡并較好恢復(fù)左心功能。但移植140 d后，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有存活的CPCs整合到心臟中，因此認(rèn)為CPCs治療的效果并不是由于整合到心臟形成新的心肌。此外，CPCs還可以產(chǎn)生外泌體，將CPCs來(lái)源的外泌體注射到鼠或豬的急性心梗的心臟時(shí)可以減小心梗面積并改善心功能，與直接注射CPCs治療有相似的效果[34]。雖然這種保護(hù)作用的機(jī)制并不完全清楚，但在細(xì)胞保護(hù)，促進(jìn)血管再生，抗纖維化及調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的M1/M2分化等過(guò)程中可能起了重要作用。事實(shí)上間充質(zhì)干細(xì)胞，ESC和iPSCs分泌的外泌體也有心肌保護(hù)作用。因此，將來(lái)可能直接應(yīng)用外泌體的無(wú)細(xì)胞方法來(lái)治療心血管疾病。

除了動(dòng)物模型，CPCs已經(jīng)在臨床上試驗(yàn)，Menasche等[35]研究小組在2015年報(bào)道了第一例利用hESCs分化的Isl1+SSEA-1+CPCs臨床治療嚴(yán)重心力衰竭的患者，3個(gè)月治療改善了患者的心功能，沒(méi)有導(dǎo)致心律失常，腫瘤形成及免疫抑制相關(guān)的副作用。他們進(jìn)一步在嚴(yán)重缺血導(dǎo)致左心功能失常的患者中應(yīng)用CPCs治療，延長(zhǎng)觀察時(shí)間并擴(kuò)大樣本后，得到類(lèi)似改善心功能及一定時(shí)期安全性的效果[36]。CPCs也被用于臨床上右心衰的治療，但最近發(fā)現(xiàn)CPCs隨著年齡的增長(zhǎng)而失去功能[37]。到2019年3月為止，大約有41 項(xiàng)以CPCs為基礎(chǔ)的心血管疾病治療的臨床試驗(yàn)已在NIH網(wǎng)站（https://clinicaltrials.gov）成功注冊(cè)，這些臨床試驗(yàn)結(jié)果如何，讓人拭目以待。

四、總結(jié)與展望

CPCs在研究心血管發(fā)育及心血管細(xì)胞治療，藥物篩選和組織工程等再生領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用前景已受到密切關(guān)注。對(duì)各種類(lèi)型的CPCs及其在增殖，分化和微環(huán)境等方面信號(hào)及調(diào)控的研究對(duì)深入理解這一類(lèi)型細(xì)胞的特征，功能和應(yīng)用會(huì)有很大的幫助。然而，仍然有很多有挑戰(zhàn)的問(wèn)題需要進(jìn)一步研究，包括如何在體外穩(wěn)定維持CPCs并大量擴(kuò)增，如何通過(guò)調(diào)控各種信號(hào)通路高效快速獲得相關(guān)的心血管細(xì)胞，及如何有效的將CPCs直接應(yīng)用于臨床心血管疾病的治療等。應(yīng)用PSCs、發(fā)育生物學(xué)及其它相關(guān)學(xué)科的研究手段和進(jìn)展對(duì)這些目前CPCs存在的問(wèn)題進(jìn)一步深入探討，可能會(huì)揭示CPCs調(diào)控的本質(zhì)并為其在再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供新的思路和手段。