劉慶宏 余宏宇 吳麗霞 延永琴
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染引起的一種病毒性肝炎。近年來,其發(fā)病率逐年上升。丙型肝炎病程長、復(fù)發(fā)率高,不僅可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥和纖維化,部分還可發(fā)展成肝硬化甚至肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[1]。目前,國內(nèi)對于丙型肝炎的形態(tài)學(xué)研究較少,尤其是肝細(xì)胞及細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)水平上的分析總結(jié)更為少見。本文在光鏡形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上通過透射電鏡觀察的方法,從超微結(jié)構(gòu)水平上觀察不同炎癥程度丙型肝炎的肝細(xì)胞及其細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),以期加深對該病的認(rèn)識。
隨機(jī)收集6例解放軍第900醫(yī)院由臨床血清學(xué)檢查確診為丙型肝炎的經(jīng)皮肝穿刺活檢標(biāo)本,其中男性和女性各3例,年齡19 ~ 74歲,平均年齡39歲。按照Ishak慢性肝炎肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)和Metarvir慢性肝炎評分系統(tǒng)判讀的輕度、中度及重度丙型肝炎,其中輕度組、中度組、重度組各2例。另隨機(jī)選取2例肝正常肝穿組織作為對照組。
參照Ishak慢性肝炎肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)和Metarvir慢性肝炎評分系統(tǒng),從隨機(jī)收集的6例丙型肝炎的蠟塊中摳取部分組織,所選取6例標(biāo)本均為灰白色條索狀組織,均按電鏡標(biāo)本要求取材,直徑約為0.1 cm,長約0.1 ~ 0.2 cm。將從選定的蠟塊中取出的肝穿標(biāo)本放置于98#汽油60 ℃溫箱中脫蠟約3 h。將脫蠟后的組織放置于1%鋨酸中繼續(xù)后固定約1 h。之后分別經(jīng)4℃冰箱中50%、70%、90%酒精梯度脫水各15 min。再放入4 ℃冰箱中90%、100%丙酮中脫水各15 min。放入環(huán)氧樹脂618和100%丙酮等比混合液中,半浸透約30 min。放入35 ℃純環(huán)氧樹脂包埋劑中,純浸透約2 h。將組織挑入事先灌注好包埋劑并作好標(biāo)記的膠囊中,使其自然下沉,并用牙簽調(diào)整其位置。放入溫箱中,分別以 35 ℃,12 h;45 ℃,12 h;60 ℃,48 h 聚合,待硬化后,取出膠囊進(jìn)行修塊、半薄定位、超薄切片和撈片,然后經(jīng)醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色后上鏡觀察并記錄結(jié)果。
1.光鏡HE及特殊染色:輕度慢性丙型肝炎可見肝細(xì)胞水腫變性,點(diǎn)狀壞死不易見;匯管區(qū)少量慢性炎癥細(xì)胞浸潤,纖維組織增生不明顯(圖1a、b);中度慢性丙型肝炎可見肝細(xì)胞水腫變性,少量點(diǎn)狀壞死,匯管區(qū)較多慢性炎癥細(xì)胞浸潤,淋巴濾泡形成,輕-中度界面炎,通過網(wǎng)纖+Masson染色顯示匯管區(qū)纖維組織增生,纖維間隔形成或者弓形纖維形成(圖2a、b);重度慢性丙型肝炎肝小葉內(nèi)點(diǎn)狀壞死較易見,匯管區(qū)多量慢性炎癥細(xì)胞浸潤,形成較大的淋巴濾泡,重度界面炎,網(wǎng)纖+Masson染色示膠原纖維增生更為明顯,弓形纖維形成,甚至可見假小葉結(jié)節(jié)形成(圖3a、b)。
2.透射電鏡枸櫞酸鉛、醋酸鈾染色:通過透射電鏡觀察,與正常肝細(xì)胞(圖4)相比較:輕度慢性丙型肝炎可見輕度肝細(xì)胞水腫變性,肝細(xì)胞內(nèi)糖原顆粒稍增多并伴少量散在脂滴形成(圖1c),肝細(xì)胞胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多(圖1d);中度慢性丙型肝炎除可見肝細(xì)胞水腫變性外,還可見明顯的纖維組織增生(圖2c),肝細(xì)胞內(nèi)可見脂滴明顯增多,并伴有部分的脂滴融合(圖2d),局灶肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見膠原纖維;重度慢性丙型肝炎肝細(xì)胞中可見較顯著的細(xì)胞器改變,其特征性表現(xiàn)為高爾基復(fù)合體破碎,線粒體出現(xiàn)凝聚、變性、腫脹、融合,顯著的的大泡性脂變(圖3c);竇周間隙膠原纖維增生明顯,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,網(wǎng)池中含不均等的絮狀低電子密度物質(zhì)(有時可形成卷曲的膜性結(jié)構(gòu)),糖原化較輕度和中度慢性丙型肝炎顯著加重,偶見核內(nèi)包涵體(圖3d)。
圖1 光鏡和透射電鏡下觀察輕度慢性丙型肝炎組織結(jié)構(gòu)
圖2 光鏡和透射電鏡下觀察中度慢性丙型肝炎組織結(jié)構(gòu)
圖3 光鏡和透射電鏡下觀察重度慢性丙型肝炎組織結(jié)構(gòu)
圖4 電鏡下觀察對照組正常肝組織結(jié)構(gòu)(枸櫞酸鉛、醋酸鈾染色,×40 000)
HCV感染引起的丙型肝炎臨床癥狀輕,但易轉(zhuǎn)化成慢性肝炎、肝纖維化或肝硬化,甚至發(fā)展成肝癌。目前,對丙型肝炎的研究多局限于臨床,在超微結(jié)構(gòu)水平上觀察丙型肝炎的研究較少。本文就不同嚴(yán)重程度丙型肝炎的超威結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察總結(jié)。
本研究在光鏡基礎(chǔ)上通過電子顯微鏡觀察不同炎癥程度丙型肝炎,發(fā)現(xiàn)輕度丙型肝炎肝細(xì)胞內(nèi)存在大量大泡性脂滴,這與Miyanari等[2]認(rèn)為的脂滴參與了傳染性病毒顆粒產(chǎn)生的研究結(jié)果較一致,他們還在脂滴周圍觀察到了脂肪包裹的病毒顆粒。相較于正常肝組織而言肝細(xì)胞水腫變性明顯,可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少,滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多。2例中度慢性丙型肝炎標(biāo)本肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見膠原纖維散布、胞漿內(nèi)脂滴稍增多,并伴有脂滴融合。有學(xué)者報道,丙型肝炎中可見分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞膜之間的高爾基體,并見在凸出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形成面發(fā)生融合性改變[3],粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池局限性擴(kuò)張,其中含中等電子密度的絮狀物[4]。重度慢性丙型肝炎的肝細(xì)胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),網(wǎng)池中含不均等的絮狀低電子密度物質(zhì)(有時可形成卷曲的膜性結(jié)構(gòu))。有文獻(xiàn)報道,肝細(xì)胞中出現(xiàn)較多離散的被包裹膜包繞的圓形同心膜組成的雙膜囊泡狀的泡狀結(jié)構(gòu)[5],然而,在2例標(biāo)本中并沒有找到該結(jié)構(gòu),這可能與本研究例數(shù)較少有關(guān)。除此之外,在重度慢性丙型肝炎中還發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)見糖原增多,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少,滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多,線粒體線凝聚、變性、腫脹和融合,甚至可見細(xì)胞核內(nèi)包涵體形成,但是,有關(guān)這些改變的相關(guān)研究甚少。
普通光學(xué)顯微鏡觀測不到HCV病毒,唯有通過透射電子顯微鏡才能觀測到。人們通過透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)了許多病毒,進(jìn)行各種病毒感染的診斷,以及開展許多有關(guān)病毒與宿主細(xì)胞之間相互作用的基礎(chǔ)研究[6]。目前只有透射電子顯微鏡有足夠高的分辨率來區(qū)分聚合病毒蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)病毒粒子[7]。近年,有研究表明丙型肝炎某些細(xì)胞器的改變可能與肝細(xì)胞癌發(fā)生有相關(guān)性,研究者們利用免疫電子顯微鏡技術(shù)對轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒Jukat T細(xì)胞的蛋白質(zhì)進(jìn)行定位,發(fā)現(xiàn)C型肝炎病毒的核心蛋白質(zhì)主要位于細(xì)胞核中,尤其是在核仁中[8]。電子顯微鏡能夠在肝損傷早期,觀察到肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,這將有助于了解慢性丙型肝炎發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制。Hassan等[9]研究HCV相關(guān)的肝癌,利用電鏡觀察相應(yīng)細(xì)胞器的超微形態(tài)圖像并對其分析,認(rèn)為電鏡觀察有利于評估肝細(xì)胞向肝癌惡性轉(zhuǎn)化的趨勢。
綜上所述,應(yīng)用電子顯微鏡觀察丙型肝炎肝細(xì)胞及其超微結(jié)構(gòu),將有助于了解慢性丙型肝炎病變程度或發(fā)病機(jī)制[10],甚至將有助于研究丙型肝炎某些細(xì)胞器的改變與肝細(xì)胞癌發(fā)生的相關(guān)性。
隨著近年來丙肝發(fā)病率的上升,其從超微結(jié)構(gòu)水平觀察研究肝細(xì)胞的改變已成為一種新的研究手段,本研究嘗試超微結(jié)構(gòu)的研究方法,觀察病變的細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)形態(tài)特點(diǎn),對比發(fā)現(xiàn)不同炎癥程度的丙型肝炎肝細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的改變不同,這可能對臨床診斷有一定的輔助作用。但限于本研究樣本量少,后期將需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。
中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版)2019年2期