EMS患者異位和在位內(nèi)膜組織ROCK1及HOXA10的表達及其意義

王志志?馮華萍?高李炎?趙紹杰

【摘要】目的 探討子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）患者異位和在位內(nèi)膜組織RhoA/Rho相關(guān)激酶1（ROCK1）及同源盒A10（HOXA10）的表達及其意義。方法 收集140例EMS患者的異位和在位內(nèi)膜組織進行ROCK1及HOXA10表達的免疫組織化學(xué)染色（免疫組化）與蛋白免疫印跡法檢測，分析患者的臨床特征與上述2種蛋白表達水平之間的關(guān)系。結(jié)果 EMS患者異位內(nèi)膜組織的 ROCK1表達陽性率為77.9%，高于在位內(nèi)膜組織的21.4%，異位內(nèi)膜組織的HOXA10表達陽性率為28.6%，低于在位內(nèi)膜組織的87.9%（P均< 0.05）。蛋白免疫印跡法顯示，異位內(nèi)膜組織的ROCK1相對表達強度高于在位內(nèi)膜組織、HOXA10 低于在位內(nèi)膜組織 （P均< 0.05）。異位內(nèi)膜組織的ROCK1、HOXA10表達陽性率與EMS患者的年齡、病程、異位內(nèi)膜分期均無關(guān)（P均> 0.05），而與EMS臨床分期有關(guān)（P < 0.05）。ROCK1與HOXA10表達陽性率有關(guān)（P < 0.05）。結(jié)論 EMS患者的異位和在位內(nèi)膜組織中ROCK1、HOXA10表達存在顯著差異，推測HOXA10可負(fù)調(diào)控ROCK1信號通路，從而調(diào)節(jié)EMS的發(fā)生與發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】子宮內(nèi)膜異位癥;RhoA/Rho相關(guān)激酶1;同源盒A10;臨床特征

Expression and significance of ROCK1 and HOXA10 in ectopic and eutopic endometrium of patients with endometriosis Wang Zhizhi， Feng Huaping， Gao Liyan， Zhao Shaojie. The Affiliated Wuxi Maternal and Child Health Care Hospital of Nanjing Medical University， Wuxi 214002， China

Corresponding author， Zhao Shaojie

【Abstract】Objective To investigate the expression and significance of ROCK1 and HOXA10 in ectopic and eutopic endometrium of patients diagnosed with endometriosis （EMS）. ?Methods One hundred and forty patients with EMS admitted to our hospital were enrolled in this study. The ectopic and eutopic endometrial tissues of 140 patients were collected for ROCK1 and HOXA10 expression detected by immunohistochemical staining and Western blot. The relationship between the clinical characteristics and the expression levels of ROCK1 and HOXA10 proteins was analyzed. ?Results In the ectopic endometrium， the positive rate of ROCK1 was 77.9%， significantly higher than 21.4% in the eutopic endometrium （P < 0.05）， whereas the positive rate of HOXA10 was 28.6%， considerably lower than 87.9% in the eutopic endometrium （P < 0.05）. Western blot revealed that the relative expression of ROCK1 in the ectopic endometrium was significantly higher， whereas the relative expression of HOXA10 was remarkably lower than those in the eutopic endometrium （both P < 0.05）. In the ectopic endometrium， the positive rates of ROCK1 and HOXA10 were not significantly correlated with the age， course and staging of ectopic endometrium （all P > 0.05）， whereas were significantly associated with the clinical staging of EMS （P < 0.05）. Association analysis of categorical variables showed that the positive rate of ROCK1 was correlated with that of HOXA10 （P < 0.05）. ?Conclusions The expression levels of ROCK1 and HOXA10 significantly differ between the ectopic and eutopic endometrial tissues of EMS patients. It is speculated that HOXA10 can negatively regulate the ROCK1 signaling pathway， thereby regulating the incidence and development of EMS.

【Key words】Endometriosis;ROCK1;HOXA10;Clinical characteristics

子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）是一種具有侵襲、復(fù)發(fā)、種植等生物學(xué)行為的婦科常見病，異位內(nèi)膜細(xì)胞能夠在宮腔外種植并存活[1]。EMS的發(fā)病機制還未完全清楚，有研究表明在EMS中有許多同源盒（HOX）基因存在異常表達[2]。HOX基因在果蠅體內(nèi)具有高度的時空特異性，也存在于酵母及人類的幾乎所有真核細(xì)胞中，包含了183個核苷酸序列組成的保守堿基序列，能編碼61個氨基酸的多肽[3]。HOXA10基因是HOX家族的重要成員，屬于B型腹型HOX基因亞家族，可參與正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜的增生和分化，其是控制女性生殖道發(fā)育、胚胎細(xì)胞植入和增殖、內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)育和分化的重要基因[4]。有研究顯示在整個月經(jīng)周期中，HOXA10基因在子宮內(nèi)膜腺體及基質(zhì)均表達，且在分泌中后期及著床期表達顯著增高[5]。RhoA/Rho相關(guān)激酶（ROCK）信號通道在體內(nèi)普遍存在，與細(xì)胞增殖關(guān)系密切[6]。但是ROCK在EMS中的作用還沒有相關(guān)報道。因此，本實驗通過采用免疫組織化學(xué)染色（免疫組化）法與蛋白免疫印跡法檢測ROCK1及HOXA10在EMS患者異位和在位內(nèi)膜組織的蛋白表達情況，并分析它們與患者臨床特征之間的相關(guān)性，從而為臨床早期診斷、治療及預(yù)后判斷提供參考，現(xiàn)總結(jié)報告如下。

對象與方法

一、研究對象

選擇2015年8月至2018年1月在我院進行腹腔鏡手術(shù)治療的140例EMS患者作為EMS組。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：符合EMS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床表現(xiàn)痛經(jīng)進行性加重，近3個月內(nèi)未服用性激素類藥物且無其他系統(tǒng)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性痛經(jīng)，合并腫瘤等疾病，臨床與病理資料不完善者。140例患者的年齡28 ～ 44歲、中位年齡37歲，臨床分期Ⅰ期80例、Ⅱ期50例、Ⅲ期10例，異位內(nèi)膜處于增生期80例、分泌期60例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，入組患者均已簽署知情同意書。

二、方 法

1. 標(biāo)本采集

腹腔鏡術(shù)中刮取140例EMS患者的異位和在位內(nèi)膜組織，所有組織均經(jīng)病理學(xué)檢查確認(rèn)，將每例組織標(biāo)本分為兩部分，一部分行蛋白免疫印跡法，另一部分以石蠟包埋，行5 μm厚連續(xù)切片，65℃烤片2 h，置于4℃長期保存。

2. 免疫組化分析

ROCK1、HOXA10山羊多克隆抗體（1∶50，1∶100）購于美國SantaCruz公司;ElivisionTM ?Plus 免疫組化試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）通用型免疫組織化學(xué)試劑盒購于大連TAKARA公司。將組織切片置于66℃ 烤箱中1 h，然后放入二甲苯中脫蠟和梯度乙醇水化，再以0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次各5 min，抗原修復(fù)后用0.01 mmol/L PBS沖洗3 次，每次各5 min，過氧化氫溶液滴于組織切片上，室溫孵育10 min，清除內(nèi)源性過氧化物酶活性，封閉組織內(nèi)非特異性抗原，抗原抗體結(jié)合，于室溫復(fù)溫45 min，滴加生物素標(biāo)記二抗，滴加親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶（HRP）、二氨聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，鏡下觀察。

ROCK1、HOXA10陽性指細(xì)胞胞漿呈棕黃色顆粒，根據(jù)染色強度及范圍分別計分：染色范圍< 5%為0分、5% ～ 20%為1分、21% ～ 50%為2分、> 50%為3分;染色程度無色為0分、淡黃為1分、棕黃為2分、棕褐為3分。兩者得分乘積判定表達陽性率，累積0 ～ 1分為陰性，≥2分為陽性。

3. 蛋白免疫印跡法檢測

選擇兔抗人ROCK1、HOXA10單克隆抗體（購自武漢博士德公司，抗體工作濃度1∶1000，1∶200）。提取新鮮異位和在位的組織標(biāo)本，加裂解液裂解，超聲儀粉碎，離心分離蛋白，采用BCA法定量蛋白濃度，80 μg蛋白/泳道行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜后在室溫下5% 脫脂牛奶封閉2 h，分別加入一抗和內(nèi)參β-肌動蛋白（β-actin），4℃ 孵育過夜，加入二抗，電化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布計量資料用表示，在位內(nèi)膜組織與異位內(nèi)膜組織間比較采用配對t檢驗;計數(shù)資料以例（%）表示，在位組織與異位內(nèi)膜組織間比較采用配對χ2檢驗，不同臨床特征間ROCK1、HOXA10陽性率比較采用χ2檢驗。分類變量相關(guān)性分析采用關(guān)聯(lián)分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、EMS患者異位和在位內(nèi)膜組織的ROCK1 表達情況比較

140例EMS患者中，異位內(nèi)膜組織的 ROCK1表達陽性率為77.9%，在位內(nèi)膜組織的ROCK1表達陽性率為21.4%，異位內(nèi)膜組織的 ROCK1表達陽性率高于在位內(nèi)膜組織（χ2 = 70.124、P < 0.001）。

二、EMS患者異位和在位內(nèi)膜組織的HOXA10表達情況比較

140例EMS患者中，異位內(nèi)膜組織的 HOXA10表達陽性率為28.6%，在位內(nèi)膜組織的HOXA10表達陽性率為87.9%，異位內(nèi)膜組織的HOXA10 表達陽性率低于在位內(nèi)膜組織（χ2 = 66.884、P < 0.001）。

三、EMS患者的異位和在位內(nèi)膜組織ROCK1、HOXA10蛋白免疫印跡結(jié)果比較

異位內(nèi)膜組織的ROCK1相對表達強度高于在位內(nèi)膜組織、HOXA10 低于在位內(nèi)膜組織（P均< 0.05）

四、EMS患者異位內(nèi)膜組織的ROCK1、HOXA10表達陽性率與臨床特征的相關(guān)性

異位內(nèi)膜組織的ROCK1、HOXA10表達陽性率與EMS患者的年齡、病程、異位內(nèi)膜分期均無關(guān)（P均>0.05），而與EMS臨床分期有關(guān)（P<0.05），見表4。

五、EMS患者異位內(nèi)膜組織的ROCK1與HOXA10表達關(guān)聯(lián)分析

在EMS患者的異位內(nèi)膜組織中，分類變量的關(guān)聯(lián)分析顯示ROCKI與HOXA10表達有關(guān)（χ2 = 4.790、P < 0.05）。

討論

EMS是臨床上的常見疾病，是指具有活性的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮以外的部位。EMS具有組織侵襲、復(fù)發(fā)、局部播散、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性行為，但是具體的發(fā)病機制還不明確[7]。EMS的發(fā)生被認(rèn)為與許多相關(guān)基因的激活和（或）失活有關(guān)[8]。

HOX基因已經(jīng)被認(rèn)為與腫瘤進展與胚胎發(fā)育密切相關(guān)，在胚胎發(fā)育過程中，HOX基因在時間和空間分布上都表現(xiàn)出了高度的特異性，其中9 ～ 13組基因調(diào)控腰骶部發(fā)育，與生殖器官的發(fā)育密切相關(guān)[9]。HOXA10基因?qū)儆贖OX基因亞家族，其N端是個富含多個脯氨酸和谷氨酰胺的區(qū)域，也為轉(zhuǎn)錄活性單位[10]。HOXA10通過直接調(diào)節(jié)下游基因，從而在子宮及胚胎著床過程中發(fā)揮重要作用[11]。EMS患者孕激素受體表達改變可導(dǎo)致孕激素反饋失調(diào)，使得孕激素敏感受體包括在位子宮內(nèi)膜HOX基因表達減低[12]。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶分子，約含有1300 個氨基酸，自N 端起有激酶催化結(jié)構(gòu)域、然后是Rho蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、PH結(jié)構(gòu)域和一個C 末端半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域[13]。RhoA/ROCK通路在細(xì)胞收縮、存活/凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、遷移、增殖和分化中起重要作用。RhoA/ROCK活化可增加細(xì)胞對鈣離子的敏感性，促進肌絲收縮，最終表現(xiàn)為平滑肌收縮，從而在血管的病理、生理中起重要作用[14]。本研究顯示，EMS患者異位內(nèi)膜組織的ROCK1相對表達強度高于在位內(nèi)膜組織，HOXA10相對表達強度低于在位內(nèi)膜組織。

HOXA10是子宮內(nèi)膜增殖和分化的調(diào)節(jié)基因，其在EMS發(fā)病中的作用值得探討。正常月經(jīng)周期受雌激素和孕激素的變化調(diào)節(jié)，而HOXA10以激素依賴的方式在人子宮內(nèi)膜組織表達;雌激素和孕激素可調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜HOXA10基因的表達，且呈劑量依賴性[15]。HOXA10也是胚胎著床和子宮內(nèi)膜蛻膜化不可缺少的基因，表達于人的整個月經(jīng)周期，在分泌中期至晚期呈現(xiàn)高表達狀況，且間質(zhì)高于腺體。由于HOX 基因的表達被認(rèn)為是隨著子宮內(nèi)膜的分化而發(fā)生變化，為此HOX基因的表達也會影響子宮內(nèi)膜增生或惡性腫瘤的發(fā)展。RhoA 是小分子G 蛋白Rho亞家族中研究最深入的成員之一，ROCK是RhoA蛋白下游最主要的效應(yīng)分子[16]。ROCK的下游靶分子包括肌球蛋白輕鏈磷酸酶、ERM家族蛋白、肌球蛋白、內(nèi)收蛋白等，隨著宮頸癌惡性程度增高，ROCK蛋白表達水平也增高，提示ROCK信號通道的激活與宮頸癌的惡性進展密切相關(guān)[17]。本研究顯示在異位內(nèi)膜組織中，ROCK1、HOXA10表達陽性率與患者的年齡、病程、疾病類型無關(guān)，而與臨床分期有關(guān);分類變量的關(guān)聯(lián)分析顯示ROCK1與HOXA10表達有關(guān)。當(dāng)前有研究表明，HOX基因通過與其下游靶基因的調(diào)控區(qū)域結(jié)合，從而激活或抑制轉(zhuǎn)錄，其中HOX10基因是通過與ROCK1基因結(jié)合形成二聚體來發(fā)揮作用[18]。也有研究顯示，機械刺激可通過RhoA/ROCK信號通路介導(dǎo)PI3K/Akt信號的活化，從而調(diào)控下游HIF-1α、VEGF的表達，參與EMS的發(fā)生與發(fā)展[19]。

綜上所述，EMS患者異位和在位內(nèi)膜組織的ROCK1、HOXA10表達存在差異，HOXA10可能通過調(diào)控ROCK1信號通路，從而影響EMS的發(fā)生與發(fā)展。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2019-03-28）

（本文編輯：林燕薇）