訶子多酚清除ＤＰＰＨ自由基的光譜學研究

李曉芬 熊華斌 張海芬 字園麗 張言 高云濤 張艷麗

摘要：對天然抗氧化活性成分訶子多酚和DPPH自由基的紫外-可見吸收光譜特征進行了研究。確定了訶子多酚清除DPPH自由基反應體系的測定波長和反應時間。研究了訶子多酚清除DPPH自由基的活性，獲得了訶子多酚清除DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50值為沒食子酸（0.000 92 mg/mL）<咖啡酸（0.003 43 mg/mL）<香草酸（0.55 mg/mL）<對香豆酸（2.27 mg/mL），其中沒食子酸和咖啡酸的活性明顯優(yōu)于蘆丁。表明沒食子酸和咖啡酸是訶子多酚中主要的抗氧化活性成分。

關(guān)鍵詞：訶子多酚;DPPH自由基;紫外-可見吸收光譜;抗氧化活性

中圖分類號：Q5? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）08-0121-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.08.028? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： The UV-Vis absorption spectrum of Terminalia polyphenol which is natural antioxidant and DPPH free radicals was investigated，and the determination wavelength and the time for the reaction of Terminalia polyphenol with DPPH free radicals were optimized. Furthermore，the DPPH free radical scavenging activity of Terminalia polyphenol was evaluated. In the optimized systems，the half inhibitory concentration （IC50） of four Terminalia polyphenol against DPPH was ranked as follows： gallic acid（0.0009 2 mg/mL）﹤caffeic acid（0.003 43 mg/mL）

Key words： Terminalia polyphenol; DPPH free radicals; ultraviolet-visible absorption spectrum; antioxidant activity

自由基氧化損傷是現(xiàn)代許多重大疾病的源泉，也是引起機體衰老的根本原因[1-3]。天然產(chǎn)物清除自由基的抗氧化劑活性研究是目前研究的熱點[4，5]。國內(nèi)外報道的測定抗氧化物質(zhì)清除自由基的方法主要包括分光光度法、化學發(fā)光法、電子自旋共振法、電化學檢測法、氣相色譜法、熒光法和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[6-11]。DPPH自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）是一種穩(wěn)定的人工合成自由基，在517 nm處有一典型的特征吸收峰，當反應體系中有抗氧化劑存在時，能與未成對的電子配對而使其特征吸收逐漸消失，褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用分光光度法進行定量分析[12]。通常利用DPPH自由基的褪色反應計算自由基清除率，目前，DPPH自由基清除試驗被廣泛用于天然植物抗氧化活性的研究，具有穩(wěn)定、快速、簡便、可靠等優(yōu)點[13-19]。

訶子（Terminalia），又名訶黎、訶黎勒、隨風子，為使君子科欖仁樹屬植物，主要分布于中國云南、廣東、廣西以及緬甸[20]。在藏藥學經(jīng)典著作《晶珠本草》中，訶子被稱為“藏藥之王”[21]。訶子醇提物主要富含多酚類物質(zhì)，具有良好的抗氧化活性以及明顯的抑菌、抗癌和抗衰老等功效[22，23]。利用DPPH自由基褪色反應研究植物多酚的抗氧化研究已有報道[24，25]，但訶子多酚清除DPPH自由基反應體系的的研究尚未見報道。

本研究以富含植物多酚的藏藥訶子為研究對象，對天然抗氧化活性成分訶子多酚和DPPH自由基的光譜學特征進行了研究，并利用光譜法研究沒食子酸與DPPH自由基反應的動力學過程，優(yōu)化了反應體系，并測定了植物多酚（沒食子酸、咖啡酸、香草酸對香豆酸）的DPPH自由基清除活性，為訶子的藥理活性研究提供了科學依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

1.1.1? 材料? 訶子購于菊花村中藥材市場（產(chǎn)于緬甸），經(jīng)篩選除雜質(zhì)后粉碎過80目篩。

1.1.2? 儀器? Agilent 1200 Series HPLC（美國安捷倫公司）;8453型UV-Vis分光光度計;AS3120A型超聲清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;層析柱（40 mm×10 mm）;恒溫水浴鍋。

1.1.3? 試劑? DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼），蘆丁標準品購于Sigma公司。標準品沒食子酸、咖啡酸、香草酸和對香豆酸（國藥集團，純度>98%）;AB-8型大孔吸附樹脂（南開大學化工廠）;所用試劑均為分析純。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 訶子多酚粗提取液的制備[26]? 準確稱取10.0 g訶子粉末，按1∶27的料液比加入270 mL 60%乙醇室溫下超聲浸提60 min，將提取液抽濾，濾液蒸發(fā)濃縮后得訶子多酚提取物浸膏，真空低溫干燥至恒重備用。

1.2.2? 訶子多酚精提取液的制備

1）AB-8樹脂的預處理[27]。大孔樹脂用95%乙醇浸泡24 h，溶脹后用乙醇沖洗至無白色渾濁液流出，用去離子水洗盡乙醇后分別用5% HCl和5% NaOH浸泡8 h，再用去離子水洗至中性，浸泡于去離子水中備用。

2）訶子粗多酚的分離純化。將訶子多酚粗提取物加適量蒸餾水溶解后過柱，上柱料液濃度1.0 mg/mL，pH 6.0。用80%乙醇進行洗脫，解吸速率為4.0 BV/h，洗脫體積為3.0 BV。洗脫液經(jīng)抽濾后蒸發(fā)濃縮，真空干燥至恒重備用。

1.2.3? 標準儲備液的配制? 準確稱取沒食子酸1.0 mg、咖啡酸1.0 mg、香草酸0.5 g、對香豆酸0.5 g，用無水乙醇溶液分別稀釋定容至10 mL，搖勻，4 ℃保存?zhèn)溆?準確配制5.0×10-3 mol/LDPPH儲備液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4? 訶子醇提物主要成分分析? 色譜條件：色譜柱：Agilent XDB-C18（4.6 mm×150 mm i.d，5 μm）;柱溫：25 ℃;流動相A：甲醇;流動相B：乙酸/水（1.0%，v/v）;梯度洗脫程序：0～10 min（5% A），10～25 min（10% A），25～26 min（50% A），26～35 min（80% A），35.0～35.1 min（100% A）。溶劑A在40 min內(nèi)由5%上升到80%，然后變?yōu)?00%，并維持5 min，最后再返回到初始狀態(tài)。流速：1.00 mL/min;進樣量：20 μL;紫外檢測器檢測波長：280 nm。

1.2.5? DPPH穩(wěn)定性試驗? 準確配制3份相同濃度的DPPH溶液，分別測定配制時及在室溫下曝光觸氧放置5 h和10 h后的紫外-可見吸收曲線。

1.2.6? DPPH自由基清除試驗? 準確移取4.5 mL DPPH標準液于10 mL比色管中，分別加入相同濃度不同體積的樣品，空白管以4.5 mL DPPH標準液，分別用無水乙醇定容至5.0 mL，搖勻，置于室溫下避光靜置30 min，測定溶液在517 nm處的吸光度，并掃描UV-Vis光譜。清除率按下式計算：

式中，A0為空白管的吸光度;A樣為樣品管的吸光度。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 訶子多酚提取物的成分分析

2.1.1? 訶子多酚提取物的定性分析? 在最佳色譜條件下測定4種酚酸標準品溶液的色譜圖如圖1（A）所示，訶子提取物的標準色譜圖如圖1（B）所示。結(jié)果表明，4種酚酸能夠成功的彼此分離，所有的化合物在一定的濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系（R2>0.999）。

2.1.2? 訶子多酚提取物的定量分析? 準確稱取不同產(chǎn)地的訶子多酚制備成供試品溶液，取20 μL濾液測定，用表1中的線性回歸方程計算。對不同產(chǎn)地的訶子進行4種酚酸含量的測定，結(jié)果見表2。

2.2? DPPH穩(wěn)定性試驗

如圖2所示，新配制的DPPH溶液吸收曲線（曲線1）在波長為328 nm和517 nm處有很強的特征吸收峰，517 nm處的吸光度隨放置時間延長而迅速下降（放置10 h后降低了0.16），328 nm處吸光度隨放置時間延長而上升（放置10 h后增加了0.22）。研究發(fā)現(xiàn)，DPPH溶液在1 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，但若在室溫下放置過長，并且接觸光和氧氣后紫紅色的DPPH溶液顏色會隨著放置時間的增長而變淺，517 nm處的吸光度降低會更加顯著。結(jié)果表明，光照和溫度都會影響DPPH溶液的光吸收。因此，DPPH溶液的保存和測定都必須在低溫避光條件下進行。

2.3? DPPH反應體系的UV-Vis吸收光譜研究

對DPPH自由基溶液和訶子多酚進行UV-Vis光譜掃描。結(jié)果如圖3（a）所示，訶子多酚的吸收峰都集中在300 nm附近，與DPPH溶液在328 nm處的吸收峰存在疊加作用。但訶子多酚大于450 nm部分無吸收，因此不會對DPPH在517 nm處的吸收峰形成疊加，測定過程不產(chǎn)生光譜干擾。

在DPPH溶液中加入不同濃度訶子多酚，結(jié)果見圖4，DPPH的A517 nm隨訶子多酚濃度的增加而呈線性降低。而在328 nm處的吸收峰，不僅存在訶子多酚吸收峰的干擾，而且加入訶子多酚之后吸收度并沒有變化，綜合上述結(jié)果，選擇517 nm作為DPPH自由基的測定波長。

2.4? 訶子多酚清除DPPH自由基反應的動力學研究[28]

圖5為反應時間對訶子多酚清除DPPH自由基反應速率的影響，在5.0×10-6 mol/L DPPH溶液中分別加入訶子醇提物和訶子酚酸后，對于抗氧化活性較強的樣品如沒食子酸、咖啡酸，體系的特征吸收峰A517 nm在10 min內(nèi)呈顯著下降趨勢，10 min后基本趨于平衡，至30 min時A517 nm達到穩(wěn)定狀態(tài)，說明對于抗氧化活性較強的抗氧化劑，30 min是一個合適的、穩(wěn)定的反應時間點;對于抗氧化活性較弱的樣品如香草酸，對香豆酸，體系的特征吸收峰A517 nm在20 min內(nèi)呈顯著下降趨勢，到30 min后體系基本趨于平衡，至60 min時，A517 nm達到穩(wěn)定狀態(tài)，說明對于抗氧化活性較弱的抗氧化劑，60 min是一個合適的、穩(wěn)定的反應時間點。

4種酚酸達到最大清除率的時間為沒食子酸（10 min）<咖啡酸（20 min）<香草酸（30 min）<對香豆酸（35 min）。

2.5? 訶子多酚清除DPPH自由基活性

根據(jù)優(yōu)化的測定波長和反應時間，測定系列濃度的訶子醇提物和多酚化合物對DPPH自由基的清除率，計算相應抗氧化劑的IC50值，并以蘆丁作對比，評價其抗氧化活性。對于DPPH（圖3）反應體系，在相應的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，訶子醇提物和4種多酚化合物對自由基清除率有良好的線性關(guān)系，據(jù)此可計算其IC50值。

如表3所示，訶子醇提物和4種多酚化合物的IC50值分別為0.002 74、0.000 92、0.003 43、0.55、2.27 mg/mL，蘆丁的IC50值為0.003 99 mg/mL，結(jié)果表明，訶子多酚對DPPH自由基具有良好的清除作用，其中沒食子酸、咖啡酸和訶子醇提物的抗氧化活性優(yōu)于蘆丁。

3? 結(jié)論

本文研究了訶子中3種多酚類物質(zhì)清除DPPH自由基的能力及其光譜學特征。研究表明，分光光度法測定訶子多酚清除DPPH自由基的測定波長為517 nm，體系穩(wěn)定時間分別為30 min（沒食子酸、咖啡酸）和60 min（香草酸、對香豆酸）。訶子多酚具有良好的抗氧化活性，能有效、快速地抑制溶液中DPPH自由基的形成及其特征吸收峰。在優(yōu)化的反應體系中，訶子醇提物和4種多酚化合物（沒食子酸、咖啡酸、香草酸、對香豆酸）的IC50值分別為0.002 74、0.000 92、0.003 43、0.55、2.27 mg/mL，其中沒食子酸和咖啡酸的活性明顯優(yōu)于蘆丁，證明沒食子酸和咖啡酸是訶子中主要的抗氧化活性成分。

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收稿日期：2018-09-14

基金項目：云南省應用基礎研究計劃項目（2017FD118）;國家自然科學基金項目（201367025）

作者簡介：李曉芬（1986-），女，云南大理人，講師，碩士，主要從事民族藥抗氧化研究，（電話）13577062851（電子信箱）wjplxf24@163.com;?通信作者，高云濤，教授，（電話）0872-65913041（電子信箱）2314972096@qq.com。