ＨＰＬＣ法測定鱉甲消痔膠囊中沒食子酸的含量

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【摘要】目的：建立HPLC法測定鱉甲消痔膠囊中沒食子酸的含量。方法：采用ThermoC18柱（250mm×4.6mm，5μm）;流動相為甲醇-0.025%磷酸溶液（4.5∶95.5），流速1.0mL/min，檢測波長為272nm;柱溫25℃。結(jié)果：沒食子酸在0.9316～46.58μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，r=1.0000;平均回收率為99.8%，RSD=1.4%（n=6）。結(jié)論：該方法簡捷，快速，可靠，可用于控制制劑的質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】鱉甲消痔膠囊;沒食子酸;含量測定;高效液相色譜法

【中圖分類號】R917【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號】1007-8517（2019）1-0036-03

Abstract：ObjectiveToestablishamethodofthecontentdeterminationofgallicacidintheAojiaxiaozhicapsulebyHPLC.MethodThermoC18column（250mm×4.6mm，5μm）wasadopted.Themobilephasewasmethanoland0.025%phosphoricacidsolution（4.5∶[KG-*3/5]95.5），withtheflowrateof1.0mL/min，anddetectionwavelengthof272nm.Thecolumntemperaturewas25℃.ResultsTherewasagoodlinearityintherangeof0.9～186.3μg/mL，r=1.0000.Theaveragerecoverywas100.3%，withRSDof1.9%（n=6）.ConclusionThemethodissimple，rapidandreliable.ItcouldbeusedtocontrolthequalityoftheAojiaxiaozhicapsule.

Keywords：AojiaxiaozhiCapsule;GallicAcid;ContentDetermination;HPLC

鱉甲消痔膠囊由地榆、地瓜藤、黃柏、土大黃、鱉甲、槐角、忍冬藤、梔子八味中藥配伍而成，具有清熱解毒、涼血止血、消腫止痛的功效。用于濕熱蘊結(jié)所致的內(nèi)痔出血、外痔腫痛、肛周瘙癢。文獻(xiàn)查詢發(fā)現(xiàn)，目前對該制劑的研究主要有：用TLC法對大黃、地榆、槐角、梔子進(jìn)行鑒別;用高效液相色譜法測定制劑中鹽酸小檗堿的含量[1-2]。為了進(jìn)一步研究該制劑，筆者選取該制劑中一種臣藥地榆，建立HPLC法測定地榆中沒食子酸的含量。地榆屬薔薇科植物，采挖后除去須根，洗凈，干燥，或趁鮮切片，干燥。具有涼血止血、解毒斂瘡之功效，用于便血、痔血、血痢、崩漏、癰腫瘡毒等癥。有文獻(xiàn)[3-4]對地榆的抗炎抑菌作用進(jìn)行了研究，研究表明地榆對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草桿菌、變形桿菌，甲型鏈球菌等細(xì)菌具有很好抑制作用。地榆中化學(xué)成分主要為鞣質(zhì)類、三萜皂苷類、黃酮類[5]，其中鞣質(zhì)類化合物是地榆的主要有效成分，沒食子酸是鞣質(zhì)的重要組成成分，也是評價地榆質(zhì)量的主要指標(biāo)[6]。沒食子酸是自然界中廣泛存在的一種多酚類化合物。有研究表明，沒食子酸具有止血、抗炎、抗突變、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、殺錐蟲等多種生物活性[7-8]。有研究證實沒食子酸體外對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用[9-10]。本實驗建立高效液相色譜法測定鱉甲消痔膠囊中沒食子酸含量。

1儀器與試藥

1.1儀器AgiLent1260高效液相色譜儀（配置四元泵、自動進(jìn)樣器、UV檢測器）;ThermoC18柱（250mm×4.6mm，5μm）;XS105電子分析天平（梅特勒上海公司）。

1.2試藥沒食子酸（90.1%，批號：110831-200803，中國食品藥品檢定研究院）。鱉甲消痔膠囊（批號：1511014、1511038、2576004，貴州漢方藥業(yè)有限公司）。流動相用試劑為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：ThermoC18（250×4.6mm，5μm;流動相：流動相0.025%磷酸-甲醇（95.5∶4.5）;流速1.0mL/min;檢測波長272nm;柱溫25℃;進(jìn)樣量：5μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液制備精密稱取沒食子酸10.34mg置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1863mg/mL沒食子酸儲備液。精密吸取沒食子酸儲備液5mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得沒食子酸對照品使用液。

2.2.2供試品溶液制備取鱉甲消痔膠囊20粒，精密稱定，混勻，取約0.8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%鹽酸溶液10mL，振搖，加入30mL純化水，搖勻，置于電爐上煮沸20min，取下，冷卻至室溫，過濾，收集濾液置于50mL容量瓶中。用水洗滌濾渣，合并濾液于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.3陰性樣品制備按處方各藥材比例及制法，制得不含地榆的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗分別取供試品溶液、對照品溶液，按上述色譜條件實驗，對系統(tǒng)適用參數(shù)進(jìn)行考察，沒食子酸理論板數(shù)為6893。理論板數(shù)大于2000[1]。

2.4線性關(guān)系考察分別精密吸取2.2.1項下的沒食子酸對照品使用液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0mL，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度;搖勻，即得系列質(zhì)量濃度的對照品溶液。在2.1項下的色譜條件下測定。以沒食子酸濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸，回歸方程為Y=17.0217X-3.6469，r=1.0000。結(jié)果表明：沒食子酸在0.9316～46.58μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。對照品、供試品、陰性對照的色譜圖見圖1。

2.5精密度試驗取同一濃度的對照品溶液，在2.1項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄沒食子酸峰面積，其RSD為0.8%（n=6）。

2.6穩(wěn)定性試驗取同一在2.2.2項下制備的樣品，在2.1項下色譜條件下分別于2、4、8、16、24h進(jìn)樣5μL，記錄峰面積，結(jié)果測得沒食子酸峰面積RSD為0.8%。表明樣品在24h穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗取同一批號樣品（批號：2576004），按照2.2.2項下方法制備6份供試品溶液，在2.1項色譜條件下測定，測得沒食子酸含有量RSD為1.2%（n=6）。

2.8加樣回收率試驗精密稱取含有量已知的鱉甲消痔膠囊（批號2576004）6份，每份約0.4g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入濃度為0.4209mg/mL的沒食子酸對照品溶液2.5mL，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，計算回收率，結(jié)果見表1。

2.9樣品測定結(jié)果取鱉甲消痔膠囊20粒，精密稱定，混勻，取約0.8g，精密稱定，平行3份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，在2.1項下的色譜條件下測定，計算含有量，結(jié)果見表2。

3討論

3.1檢測波長的選擇取沒食子酸對照品溶液在200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，沒食子酸在272nm處有最大吸收，與中國藥典地榆含量測定項下選用波長一致，故選擇272nm為檢測波長。

3.2流動相的選擇首先嘗試了甲醇和水做流動相，經(jīng)進(jìn)樣檢測，結(jié)果峰型不好，然后參考中國藥典[1]地榆含量項下流動相甲醇-0.05%磷酸溶液（5∶95），發(fā)現(xiàn)峰型變好，但目標(biāo)峰與相鄰的雜峰分離不是很好，而且雜峰較多，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[11-13]，改變磷酸溶液濃度為0.025%，發(fā)現(xiàn)峰型變好，分離度符合要求，故選擇0.025%磷酸-甲醇（4.5∶95.5）作為流動相。

3.3提取方式的選擇通過參考中國藥典[1]和文獻(xiàn)[14-15]，嘗試用水和不同濃度（30%、50%、70%）的乙醇作為提取溶劑，煮沸和回流兩種提取方式，提取時間（10min、20min、30min、40min）。結(jié)果用水做溶劑通過煮沸含量較高，三種不同濃度乙醇回流含量無明顯差異且比水煮沸含量低。提取時間20min、30min、40min含量無明顯變化。但同時發(fā)現(xiàn)以上幾種提取出的供試品中目標(biāo)峰型較差，而且雜峰多，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[16-17]了解到PH對沒食子酸穩(wěn)定性影響較大，沒食子酸在酸性條件下穩(wěn)定，隨PH值增加穩(wěn)定性逐漸下降，堿性條件下極不穩(wěn)定。嘗試加入不同濃度（2%、5%、10%、15%）的鹽酸溶液。鹽酸溶液加入體積有5、10mL兩種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入10%鹽酸溶液10mL，沒食子酸含量測定值最高且與加入15%鹽酸溶液10mL無明顯差異。綜合以上實驗，確定了本法的提取方式。

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（收稿日期：2018-07-13編輯：劉斌）