ＨＰＬＣ法測(cè)定箭根薯中薯蕷皂苷元的含量

王志杰 張偉 彭霞 姜明輝 卯明霞

【摘 要】目的：測(cè)定箭根薯中薯蕷皂苷元的含量。方法：HPLC法，色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠;乙腈-水（90∶10）為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm，流速為1.0mL/min，柱溫35℃。理論板數(shù)以薯蕷皂苷元峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。結(jié)果： 薯蕷皂苷元在0.5370～6.716μg的范圍內(nèi)線性良好，r=0.9996;平均加樣回收率（n=6）為101.5%，RSD為1.1%;樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定，日內(nèi)精密度良好，RSD = 0.65%。結(jié)論：此法簡(jiǎn)便、可靠，可用于箭根薯中的薯蕷皂苷元的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法;箭根薯;薯蕷皂苷元;含量

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）5-0027-04

箭根薯是傣醫(yī)常用藥之一，傣語(yǔ)稱咪火蛙，意譯為“味苦似牛膽”，為蒟蒻薯科蒟蒻薯屬植物箭根薯（Tacca chantrieri Andre）的干燥塊莖（見(jiàn)圖1～2）。性味苦、涼，入水、風(fēng)塔。具有清火解毒，消腫止痛，排膿生肌，止咳化痰功效。用于瘡瘍腫毒，痄腮，乳癰，咽喉腫痛、咳嗽痰多，脘腹疼痛，解食毒[1]。箭根薯是傣藥雅解片、西雙版納州傣醫(yī)院制劑“解毒養(yǎng)顏膠囊”、“健胃止痛膠囊”、“五寶膠囊”處方藥材之一。箭根薯含有薯蕷皂苷元、豆甾醇、胡蘿卜甙、根薯酮內(nèi)酯類化合物[2-3]。據(jù)報(bào)道利用多種波譜技術(shù)從箭根薯的根及根莖中分離鑒定出10多個(gè)根薯酮內(nèi)酯類化合物[4]。薯蕷皂苷元 （Diosgenin）又名薯蕷皂素，是薯蕷皂苷的水解產(chǎn)物[5-6 ];該化合物具有溶血、降血脂、抗菌、消炎、抗腫瘤作用[7-11]。目前，箭根薯藥材的標(biāo)準(zhǔn)收載于《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2005年版第一冊(cè)中，應(yīng)用HPLC法對(duì)其中薯蕷皂苷元的含量測(cè)定并未見(jiàn)報(bào)道。參考文獻(xiàn)[12-15]采用了HPLC法對(duì)其中薯蕷皂苷的水解產(chǎn)物薯蕷皂苷元進(jìn)行含量測(cè)定，建立箭根薯中薯蕷皂苷元含量測(cè)定方法，為箭根薯質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考方法和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀，T-214型電子天平（德國(guó)賽多利斯），MS205DU型十萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多）。

1.2 材料 薯蕷皂苷元對(duì)照品（批號(hào)：111539-200001，中國(guó)食品藥品檢定研究院）使用前置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12h后使用。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。箭根薯樣品采自西雙版納州景洪市和勐臘縣，經(jīng)西雙版納州食品藥品檢驗(yàn)所彭霞主任藥師鑒定為蒟蒻薯科蒟蒻薯屬植物箭根薯干燥塊莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠;流動(dòng)相：乙腈-水（90∶10）;檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm;流速：1.0mL/min;柱溫：35℃;進(jìn)樣量：10μL。理論塔板數(shù)按薯蕷皂苷元峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。薯蕷皂苷元峰與前后峰分離度應(yīng)大于1.5。在此色譜條件下，薯蕷皂苷元對(duì)照溶液色譜圖和供試品溶液色譜圖如圖3～4所示。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備 取本品粉末2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定重量，加熱回流1h，放至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25mL，置具塞錐形瓶中，蒸干，殘?jiān)?mol/L鹽酸溶液25mL使溶解，加熱回流1h，取出，放至室溫，用石油醚（60～90℃）振搖提取4次，每次25mL，合并石油醚（60～90℃）提取液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取薯蕷皂苷元對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，即得。

2.3 方法學(xué)考察 按《中國(guó)藥典》2015年版四部“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”（通則9101）[16]的要求進(jìn)行方法驗(yàn)證。

2.3.1 線性關(guān)系考察 取濃度為671.6μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇配制得53.70、100.6、144.2、263.0、671.6μg/mL的對(duì)照品溶液，搖勻。按上述色譜條件分別進(jìn)樣10μL，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。本品進(jìn)樣量在0.5370～6.716μg的范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為：Y=7.4659X-8.02026（r=0.9996）。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的供試品（批號(hào)：20130911）6份，分別按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照上述相同色譜條件測(cè)定，按干燥品計(jì)算，薯蕷皂苷元含量的RSD為1.2%（n=6）。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次的供試品溶液（批號(hào)：20130911），在0、2、6、12、18、24h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得薯蕷皂苷元峰面積的RSD為0.65%。結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：20130911）約1.0g，分別加入6個(gè)具塞錐形瓶中，分別加入對(duì)照品約3.9mg，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.5 樣品測(cè)定 按上述色譜條件測(cè)定，分別測(cè)定4個(gè)不同產(chǎn)地4批樣品，按干燥品計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 用二極管陣列檢測(cè)器分析比較了薯蕷皂苷元對(duì)照品色譜峰和樣品所測(cè)成分相應(yīng)色譜峰的紫外光譜。試驗(yàn)證明，兩者的紫外光譜基本一致，均在203nm處有一最大吸收峰，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm。

3.2 流動(dòng)相的選擇 在其他因素不變的情況下，比較不同比例的甲醇-水、乙腈-水-冰醋酸溶液、乙腈-水作為流動(dòng)相對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，以乙腈-水溶液（90∶10）作為流動(dòng)相，被測(cè)成分色譜峰拖尾因子和分離效果最好。因此，確定乙腈-水溶液（90∶10）為該分析方法的流動(dòng)相。

3.3 色譜拄溫度的選擇 在其他因素不變的情況下，比較不同色譜拄溫度（25℃、30℃、35℃）對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)色譜拄溫度35℃時(shí)被測(cè)成分色譜峰拖尾因子和分離效果最好。因此，確定35℃為該分析方法的色譜柱溫度。

3.4 考察鹽酸濃度的選擇 取供試品（批號(hào)：20130911），分別選用了2、3、4mol/L鹽酸溶液進(jìn)行水解，結(jié)果三者測(cè)定值分別為3.74、3.92、3.93mg/g，取3mol/L鹽酸溶液時(shí)，已經(jīng)能水解完全，考慮到經(jīng)濟(jì)成本，故選擇3mol/L。

3.5 加熱回流提取時(shí)間考察 在其它條件不變的情況下，取供試品（批號(hào)：20130911），分別進(jìn)行了0.5、1、2h回流提取，結(jié)果三者測(cè)定值分別為3.61、3.92、3.91mg/g，說(shuō)明1h已基本提取完全，考慮到經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本等因素，故選擇加熱回流提取時(shí)間為1h。

3.6 水解時(shí)間考察 取供試品（批號(hào)：20130911），選用了0.5、1.0、2.0h進(jìn)行水解，結(jié)果三者測(cè)定值分別為1.92、3.94、3.91mg/g，說(shuō)明1h已基本水解完全，考慮到經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本等因素，故選擇水解時(shí)間為1.0h。

3.7 提取次數(shù)考察 取供試品（批號(hào)：20130911），分別進(jìn)行了3、4、5次提取，結(jié)果三者測(cè)定值分別為3.55、3.93、3.94mg/g，說(shuō)明4次已基本提取完全，考慮到經(jīng)濟(jì)和人工成本等因素，故選擇提取次數(shù)為4次。

3.8 耐用性試驗(yàn) 《中國(guó)藥典》2015年版四部“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”（通則9101）[16]，規(guī)范了中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法，為了進(jìn)一步驗(yàn)證“HPLC測(cè)定箭根薯中薯蕷皂苷元含量”方法的可靠性，筆者參照該指導(dǎo)原則以測(cè)定方法進(jìn)行了驗(yàn)證。為了給本方法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)，對(duì)其耐用性試驗(yàn)進(jìn)一步探討，考察了隨機(jī)變動(dòng)因素對(duì)精密度的影響?？疾炝瞬煌V柱：Agilent XDB-C18 （5μm，250mm×4.6mm）;InertSustain C18 （5μm， 250mm×4.6mm）;資生堂MGⅡ C18（5μm，150mm×4.6mm）、不同檢測(cè)波長(zhǎng)（201nm、203nm、205nm）。結(jié)果基本一致，進(jìn)一步確保了試驗(yàn)方法的科學(xué)性及數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，為箭根薯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了科學(xué)依據(jù)。箭根薯的同屬植物裂果薯發(fā)現(xiàn)較好的抗癌活性[17-19]，目前對(duì)箭根薯研究報(bào)道較少，希望此研究為今后箭根薯的進(jìn)一步研究、應(yīng)用、開(kāi)發(fā)提供參考。

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（收稿日期：2018-12-25 編輯：陶希睿）