miR-125b在食管鱗癌中的表達(dá)變化及臨床意義

方玉松 劉峻嶺 張志平 王宗明 尹立國(guó) 許鵬

食管癌是一種高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，病死率高，危害極大。我國(guó)是食管癌的高發(fā)地區(qū)，病理類型以食管鱗癌為主[1]。盡管近年來(lái)手術(shù)技術(shù)和藥物治療手段取得一定的進(jìn)步，但絕大多數(shù)食管癌患者仍難免死于腫瘤局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年總體生存率仍較低[2]。食管癌的形成過(guò)程中牽涉到一系列基因和表觀遺傳學(xué)變化，具體作用機(jī)制尚不清楚。雖然近年來(lái)的研究在分子生物學(xué)水平上取得了很大的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了食管癌發(fā)生發(fā)展中許多重要的分子事件，但仍不能有效地做到早期檢測(cè)、早期診斷和特異性治療。因此，對(duì)食管癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的深入研究是早期診斷和治療食管癌、提高食管癌患者生存率的關(guān)鍵。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一組由19～25個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼小RNA，在機(jī)體基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要的作用[3]。越來(lái)越多的研究已證實(shí)miRNA能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移能力，并且在腫瘤的早期診斷、特異性治療及預(yù)后判斷方面具有良好的前景[4]。在食管癌的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中目前也發(fā)現(xiàn)了許多異常表達(dá)的miRNA[5]。miR-125b是miRNA家族的重要成員之一，研究顯示miR-125b在胃癌[6]、甲狀腺癌[7]、骨肉瘤[8]等許多惡性腫瘤中表達(dá)異常,與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)，參與了惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程。但目前有關(guān)miR-125b在食管鱗癌中的研究甚少。本研究檢測(cè)了miR-125b在食管鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)變化，并進(jìn)一步分析其與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，以期為食管癌的早期診斷及預(yù)后判斷提供新的方向。

材料與方法

一、 研究對(duì)象

1. 組織標(biāo)本和資料：選取2012年1月—2013年1月在山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院行手術(shù)切除的89例食管癌手術(shù)標(biāo)本，均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為鱗狀細(xì)胞癌。癌組織標(biāo)本取自手術(shù)切除標(biāo)本中肉眼觀察的腫瘤組織，癌旁組織標(biāo)本取自距離腫瘤邊緣至少5 cm的無(wú)瘤組織標(biāo)本。標(biāo)本離體后立即液氮暫存，后保存于-80 ℃冰箱待測(cè)。89例患者均具有完整的臨床病歷資料，術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療等特殊抗腫瘤治療，于術(shù)后開始隨訪，隨訪至患者死亡或者術(shù)后5年，失訪及其他原因的死亡作為截尾數(shù)據(jù)。所有患者對(duì)本研究知情，并簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2. 細(xì)胞和主要試劑:人低分化食管鱗癌細(xì)胞系KYSE410、TE-13，人高分化食管鱗癌細(xì)胞系EC9706、KYSE510及人正常食管細(xì)胞系Het-1均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。所有細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(青霉素100 mg/L、鏈霉素100 mg/L)，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每隔2～3 d傳代1次。TRIzol試劑購(gòu)自北京天根生化公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；PCR引物由廣州銳博生物科技公司設(shè)計(jì)合成。

二、 qRT-PCR檢測(cè)miR-125表達(dá)

按照TRIzol試劑說(shuō)明書操作分別提取食管鱗癌組織、癌旁組織、食管鱗癌細(xì)胞系中的總RNA。取100 ng總RNA, 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以合成的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒說(shuō)明書配置反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 變性5 s，60 ℃ 退火34 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。miR-125引物：正向：5′-TCCCTGAGACC CTAACT TGTGA-3′，反向：5′-GCGAGCACAGAATTAATA CGAC-3′；內(nèi)參U6引物：正向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA TACT-3′，反向：5′-ACGCTTC ACGAATTT GCGTGTC-3′。以2-△△Ct法表示miR-125b的相對(duì)表達(dá)量。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、 miR-125b的表達(dá)

1. 體外培養(yǎng)的食管鱗癌細(xì)胞和食管正常細(xì)胞：qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，食管鱗癌細(xì)胞(KYSE410、TE-13、EC9706、KYSE510)中miR-125b的表達(dá)顯著低于正常食管細(xì)胞Het-1A(P<0.05)，且在低分化食管鱗癌細(xì)胞(KYSE410、TE-13)中miR-125b的表達(dá)顯著低于高分化食管鱗癌細(xì)胞(EC9706、KYSE510)(P<0.05)(圖1A)。

2. 食管鱗癌組織和癌旁組織標(biāo)本

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中miR-125b表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)(圖1B)。

二、 miR-125b的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

以miR-125b的中值為界值，將患者分為低表達(dá)組45例和高表達(dá)組44例。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：miR-125b低表達(dá)與pTNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤長(zhǎng)度及浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P>0.05)(表1)。

圖1 miR-125b的表達(dá)。A. miR-125b在體外培養(yǎng)的食管鱗癌細(xì)胞和食管正常細(xì)胞中的表達(dá)。1～5分別表示Het-1、EC9706、KYSE510、KYSE410、TE-13。與Het-1比較，*P<0.05；與EC9706比較，#P<0.05；與KYSE510比較，△P<0.05。B. miR-125b在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá)。與癌旁組織比較，*P<0.05

參數(shù)低表達(dá)組(N=45)高表達(dá)組(N= 44)χ2值P值性別0.2790.597 男性32(52.46)29(47.54) 女性 13(46.43)15(53.57)年齡/歲1.4650.226 ≥ 60性40(53.33)35(46.67) <60性5(35.71)9(64.29)分化程度5.2980.021 中高分化22(40.74)32(59.26) 低分化23(65.71)12(34.29)腫瘤長(zhǎng)度2.5890.108 ≥ 5 cm24(60.00)16(40.00) < 5 cm21(42.86)28(57.14)pTNM分期5.9510.015 Ⅰ期+ⅡA期17(37.78)28(62.22) ⅡB期+Ⅲ期28(63.64)16(36.36)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8.4610.004 有26(68.42)12(31.58) 無(wú)19(37.25)32(62.75)

三、 食管鱗癌組織中miR-125b表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：miR-125b低表達(dá)組總生存率顯著低于miR-125b高表達(dá)組(P<0.05)(圖3)。Cox回歸多因素分析顯示：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期、miR-125b低表達(dá)是食管癌根治術(shù)后患者 預(yù)后的獨(dú)立影響因子(P<0.05)(表2)。

圖3 食管鱗癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

因素HR95% CIP值性別1.4490.901～2.4210.119年齡1.1260.757～1.8970.178分化程度0.7240.495～1.2140.226腫瘤長(zhǎng)度1.3540.799～2.2500.137pTNM分期2.2681.517～4.0140.031淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移2.7811.716～4.4360.014miR-125b表達(dá)3.1472.358～5.5780.009

討 論

食管癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率均較高的惡性腫瘤之一，雖然食管癌的手術(shù)治療及放化療方面在一定程度上取得了進(jìn)步，但由于食管癌的早期診斷困難，其5年生存率仍沒(méi)有取得明顯的提高，因此尋找能夠用于食管癌篩選、早期診斷及預(yù)后判斷的有效的分子標(biāo)志物意義重大，也是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前，食管癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不完全明確，研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在惡性腫瘤中異常表達(dá)，調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷方面起著重要的作用，已成為目前腫瘤研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[9]。研究已經(jīng)證實(shí)，許多miRNA表達(dá)失衡在食管癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，與食管癌的分期及預(yù)后密切相關(guān)[10]。Chang等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)miR-655在食管癌中表達(dá)降低，并且與食管癌的不良預(yù)后密切相關(guān)，上調(diào)miR-655的表達(dá)能夠抑制食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲。陳述等[12]通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)中國(guó)新疆地區(qū)食管癌組織中miRNA水平進(jìn)行篩查，最終通過(guò)qRT-PCR證實(shí)miR-181c-3p和miR-5692b在食管癌組織中表達(dá)升高，并且認(rèn)為miR-181c-3p和miR-5692b可作為食管癌進(jìn)展和預(yù)后的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)。

miR-125b是近期新發(fā)現(xiàn)的miRNA家族成員之一，定位于人類染色體19q13，研究發(fā)現(xiàn)其在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化、侵襲及轉(zhuǎn)移等眾多腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活性方面發(fā)揮著重要作用[13]。既往研究顯示miR-125b在胃癌[6]、腎細(xì)胞癌[14]等癌組織中表達(dá)增高，作為癌基因發(fā)揮作用，而在甲狀腺癌[7]、骨肉瘤[8]、乳腺癌[15]等癌組織中表達(dá)降低，作為抑癌基因發(fā)揮作用。因此認(rèn)為，miR-125b可能在不同的腫瘤、不同的上下游通路中發(fā)揮著不同的作用。本研究中我們通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了食管鱗癌組織、癌旁組織和食管鱗癌細(xì)胞系、人正常食管細(xì)胞系中miR-125b的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-125b在食管鱗癌組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯降低，并且miR-125b在食管鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)較人正常食管細(xì)胞系明顯降低，提示miR-125b在食管鱗癌中可能起著抑癌基因的作用。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，miR-125b在低分化食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于高分化食管鱗細(xì)胞，并且食管鱗癌組織中miR-125b低表達(dá)與pTNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度相關(guān)，進(jìn)一步提示miR-125b的異常低表達(dá)與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

目前有關(guān)miR-125b表達(dá)異常與惡性腫瘤患者預(yù)后關(guān)系的研究較少。Wu等[6]在研究中發(fā)現(xiàn)胃癌組織中miR-125b的異常高表達(dá)的胃癌患者5年生存率較低。Li等[16]報(bào)道腦膠質(zhì)瘤組織中miR-125b高表達(dá)的患者預(yù)后較差。Luo等[17]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血清中miR-125b低表達(dá)患者無(wú)病生存期和總生存期較短。至今尚未見miR-125b與食管鱗癌患者預(yù)后關(guān)系的研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b低表達(dá)組患者的預(yù)后較差，并且miR-125b低表達(dá)是影響食管癌根治術(shù)后患者預(yù)后的獨(dú)立影響因子。

綜述所述，miR-125b在食管鱗癌組織和細(xì)胞中表達(dá)異常降低，食管鱗癌中miR-125b的異常低表達(dá)與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后具有相關(guān)性，為尋找食管鱗癌早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)分子生物學(xué)標(biāo)志物提供了新的參考。