GC法測定牛黃上清丸中冰片的含量

龐 靜，王學濤，王 健，王 昱，王曉云*

（1.秦皇島市食品藥品檢驗中心，河北 秦皇島 066000；2.秦皇島市藥品不良反應監(jiān)測中心，河北 秦皇島 066000）

牛黃上清丸為甲類OTC藥物，1977至2015年版《中國藥典》均有收載，處方來源于明代李梃《醫(yī)學入門》牛黃上清丸加減方，處方由人工牛黃、薄荷、菊花、荊芥穗、白芷、川芎、梔子、黃連、黃柏、黃芩、大黃、連翹、赤芍、當歸、地黃、桔梗、甘草、石膏、冰片十九味藥組成，具有清熱瀉火，散風止痛的功效。用于熱毒內盛、風火上攻所致的頭痛眩暈、目赤耳鳴、咽喉腫痛、口舌生瘡、牙齦腫痛、大便燥結[1-2]。

方中冰片為傳統(tǒng)常用中藥，首載于《新修本草》，具有開竅醒神，清熱止痛的功效，在方中為佐藥[2]。冰片來源較為復雜，成分亦有所不同，為龍腦香科植物龍腦香樹脂的加工品或為樟腦、松節(jié)油等用化學方法合成的加工制成品[3]，前者稱為天然冰片，后者稱為合成冰片。天然冰片的成分幾乎為純粹的右旋龍腦，而合成冰片中同時含有龍腦與異龍腦，是現(xiàn)階段商品冰片的主要來源[4-5]。牛黃上清丸現(xiàn)執(zhí)行2015年版《中國藥典》（一部）標準，標準中無冰片含量控制項，為保證原藥材質量，保證制劑成品質量穩(wěn)定，有效控制臨床療效，在現(xiàn)有文獻報道的基礎上[5-9]，本文采用氣相色譜法測定牛黃上清丸中龍腦和異龍腦的含量，以其總和計算冰片的含量，同時測定了冰片中樟腦的含量，并對檢驗結果進行了分析與探討，為制訂完善的質量控制標準提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890A氣相色譜儀、FID檢測器（美國安捷倫公司），AG-135型十萬分之一電子天平(Mettler Toledo)，DL-1028H型超聲波清洗器（Bandelin）。

1.2 試藥

龍腦對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110881-201107，含量99.3 %）、異龍腦對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111512-200802，含量97.5 %）、樟腦對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110747-201008，含量：99.0 %）；牛黃上清丸樣品（均為大蜜丸）由1～9藥廠提供；無水乙醇為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-FFAP（30 m×0.320 mm，0.25 μm）；柱溫：120 ℃；進樣口溫度：160 ℃；柱流量：1.0 ml/min；進樣方式：分流進樣；進樣量：1 μl；分流比：10:1；載氣：高純氮氣；檢測器：FID檢測器；檢測器溫度：200 ℃；氮氣：氫氣：空氣（1:1:10）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取龍腦對照品37.53 mg，置25 ml量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得龍腦對照品儲備液。精密稱取異龍腦對照品25.37 mg，置25 ml量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得異龍腦對照品儲備液。精密稱取樟腦對照品10.15 mg，置100 ml量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得樟腦對照品儲備液。分別精密量取5 ml龍腦對照品儲備液、5 ml異龍腦對照品儲備液和1 ml樟腦對照品儲備液，置50 ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得149.069 μg/ml龍腦、98.943 μg/ml異龍腦和2.010 μg/ml樟腦的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取牛黃上清丸適量，剪碎，混勻，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無水乙醇25 ml，密塞，稱定重量，放置過夜，超聲處理（功率1200 W，頻率25 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定重量，用無水乙醇補足減失的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖1 HPLC色譜圖

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按牛黃上清丸處方比例及制備工藝，取冰片以外的18味中藥材適量，按照質量標準[1]中[制法]項依法操作，制成大蜜丸，并按2.2.2項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

取2.2項下的混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按2.1項下色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。結果表明，供試品溶液的色譜圖中，在與混合對照品溶液的色譜圖相應的位置上，有相同保留時間的色譜峰，且3種成分與相鄰共存成分均可達到基線分離（R≥1.5）；而陰性樣品溶液在此保留時間處無干擾。

2.4 線性關系考察

分別精密量取2.2.1項下混合對照品溶液0.5，1.0，2.5，5.0，7.5，10.0 ml，置10 ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得不同濃度系列的對照品溶液，按2.1項下色譜條件分別進樣，測定峰面積。分別以龍腦、異龍腦及樟腦的濃度（μg/ml）為橫坐標(X)，以其各自的峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程：龍腦Y=25.0049X-1.5701（r=1.0000）；異龍腦Y=24.0310X-1.7772（r=1.0000）；樟腦Y=22.97052X+0.63483（r=0.9991）。結果表明，龍腦、異龍腦、樟腦分別在7.453～149.069 μg/ml、4.947～98.943 μg/ml、0.100～2.010 μg/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取2.2.1項下的混合對照品溶液5.0 ml，置于10 ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測得龍腦、異龍腦、樟腦峰面積的RSD分別為0.72 %，0.65 %，0.80 %（n=6）。結果表明，儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取2.2.2項下制備的供試品溶液，按2.1項下色譜條件，分別于配制后在室溫下放置0，4，12，24，30 h各精密吸取1 μl進樣測定，測得龍腦、異龍腦、樟腦峰面積的RSD分別為0.92 %，1.10 %，1.10 %（n=5）。結果表明，供試品溶液在30 h內穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

取同批號（批號：15015669）的樣品6份，精密稱定，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別進樣測定，測得龍腦、異龍腦、樟腦的平均含量分別為2.7380，2.1540，0.01356 mg/g，RSD分別為1.07 %，0.98 %，1.08 %（n=6）。結果表明，方法重復性良好。

表1 加樣回收率測定結果

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量（龍腦2.7380 mg/g、異龍腦2.1540 mg/g、樟腦0.01356 mg/g）的牛黃上清丸（批號為15015669）9份，每份約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，制備3個濃度的供試品溶液，每個濃度平行制備3份，分別按供試品含量的50 %，100 %，150 %精密加入按2.2.1項下方法配制的混合對照品溶液（龍腦1.3008 mg/ml、異龍腦1.0023 mg/ml、樟腦6.116 μg/ml）0.5，1.0，1.5 ml，按2.2.2項下方法自“精密加入無水乙醇25 ml，……”起，制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，測得龍腦、異龍腦、樟腦的平均回收率分別為100.34 %，98.13 %，98.49 %，RSD分別為1.15 %，1.01 %，0.80 %（n=9）。結果表明，本方法回收率較好。

2.9 樣品含量測定

取9個廠家樣品，分別按2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表2

表2 牛黃上清丸的含量測定結果

3 討論

3.1 檢測指標的選擇

天然冰片中主要含右旋龍腦；合成龍腦中，以樟腦的還原反應得到的合成冰片，異龍腦和樟腦含量均較高；而以松香油中α-蒎烯為原料經酯化、水解得到的合成冰片，含有較多的左旋龍腦和較少的右旋龍腦[10]。由于冰片來源復雜，藥物制劑中冰片通常為合成品，在生產過程中有異龍腦生成，用氣相色譜分析為龍腦和異龍腦兩個峰，又經查閱文獻，2015年版《中國藥典》（一部）牛黃解毒軟膠囊[1]含量測定項下及付萍萍等的《氣相色譜法測定醋酸氟輕松冰片乳膏中冰片含量》[8]、林染等的《氣相色譜法測定田七痛經膠囊中冰片含量》中均以龍腦與異龍腦總量來計算冰片的含量，本文最終選擇以龍腦與異龍腦總量來計算冰片的含量，以控制冰片的質量。另有報道稱，樟腦的成分具有一定的毒性，對嬰幼兒的影響最為嚴重[11]，因此同時測定了冰片中樟腦的含量，但沒有制定樟腦的限量，可為制定牛黃上清丸中樟腦的限量檢查方法提供參考。

3.2 提取時間的選擇

在供試品溶液制備試驗中分別以超聲20 min、30 min、40 min進行提取時間的篩選，經考察龍腦、異龍腦、樟腦的含量無明顯差異，最終綜合考慮到提取率和操作簡便，確定提取時間為30 min。

3.3 檢驗結果分析及建議

在含量測定中發(fā)現(xiàn)，所有檢驗結果中均存在異龍腦、樟腦，說明所搜集的牛黃上清丸中使用的冰片均為合成冰片；有2個廠家冰片含量較低，可能與原藥材的質量差異有關，故對牛黃上清丸中冰片的含量進行測定是非常有必要的。

綜上所述，本方法操作簡單、結果準確、重復性良好，可用于牛黃上清丸中冰片的質量控制，并可為冰片中樟腦的相關檢查及限度制定提供參考。