植物合成生物學(xué)課程實驗教學(xué)初探

潘煒松 汪啟明 譚成方 劉齊軍

摘 要 植物合成生物學(xué)是生命科學(xué)相關(guān)專業(yè)重要的前沿專業(yè)課程，課程實驗對于學(xué)生深刻把握合成生物學(xué)的學(xué)科理念和實驗技術(shù)具有重要的意義。結(jié)合教學(xué)實踐，本文介紹了我校植物合成生物學(xué)課程實驗的設(shè)計思路和實踐經(jīng)驗。

關(guān)鍵詞 植物合成生物學(xué) 創(chuàng)新人才 人才培養(yǎng)

中圖分類號：G424? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ?DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2019.04.048

Abstract Plant synthetic biology is an important specialized course of life science. The experiment teaching of plant synthetic biology is of great significance for students to grasp the concept and experimental technology of synthetic biology. Combining with teaching practice in our university， this paper introduces the design idea and practical experience of the experiment of plant synthetic biology.

Keywords plant synthetic biology; innovating talent; cultivation

2010年5月21日，美國生物學(xué)家及企業(yè)家J. Craig Venter領(lǐng)導(dǎo)的合成生物學(xué)研究團隊在Science發(fā)表了具有劃時代意義的研究成果——首個人造生命（命名為“辛西婭，Synthia 1.0”）。其通過完全化學(xué)方法合成的基因組包含約901個基因序列，長達100萬堿基對。[1]在初代辛西婭的基礎(chǔ)上，6年后該團隊繼續(xù)在Science雜志報告稱，他們設(shè)計并合成出一種具有最小基因組的微生物（“Synthia 3.0”），辛西婭3.0具有473個基因，在實驗室條件下可以自我復(fù)制。[2]這些成果是合成生物學(xué)領(lǐng)域的里程碑式進展，大大推進了對生命奧秘的認知。合成生物學(xué)作為一種方興未艾的具有顛覆性意義的新興技術(shù)，已迅速發(fā)展為一門新興的交叉學(xué)科，其重要的研究意義和巨大的應(yīng)用前景引起了科學(xué)界乃至社會各界廣泛的關(guān)注和討論。

2017年科技部《“十三五”生物技術(shù)創(chuàng)新專項規(guī)劃》指出，合成生物技術(shù)為顛覆性技術(shù)，要突破人工生命元器件、基因線路和生物計算、人工生命體，構(gòu)建DNA合成與組裝、生物計算與設(shè)計、元件木塊底盤庫共享平臺，以及可生產(chǎn)化學(xué)品、材料、天然產(chǎn)物、生物能源的人工細胞工廠，搶占合成生物學(xué)戰(zhàn)略制高點。針對合成生物學(xué)蓬勃發(fā)展的現(xiàn)狀，及其巨大的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿?，作為生命科學(xué)專業(yè)的本科生有必要對這一學(xué)科進行深入的了解。這門學(xué)科盡管建立時間不長，但發(fā)展極其迅猛，其理論研究意義和工業(yè)應(yīng)用潛力已逐漸凸顯。目前國內(nèi)普通高校中面向生命科學(xué)相關(guān)專業(yè)本科生開設(shè)這門課程的不是很多，但許多國外一流高校（如MIT、哈佛大學(xué)等）以及有些國內(nèi)985高校已經(jīng)開始將其作為高年級本科生的專業(yè)課程。作為生命科學(xué)相關(guān)專業(yè)的教師，筆者認為將合成生物學(xué)作為的一門高級選修課程，面向生物工程、生物科學(xué)、生物技術(shù)等專業(yè)高年級本科生介紹這門新興學(xué)科的學(xué)科理念、技術(shù)體系和應(yīng)用價值等是極有必要的。鑒于植物學(xué)科在農(nóng)林院校的優(yōu)勢地位，我們首先向?qū)W生介紹植物合成生物學(xué)課程。本文就植物合成生物學(xué)選修課程的實驗部分的開設(shè)作一簡要介紹。

合成生物學(xué)創(chuàng)新發(fā)展了一系列優(yōu)秀的實驗技術(shù)，從基本功能元件的構(gòu)建與標準化，到高通量的微芯片基因合成技術(shù)與各種尺度（從bp至Mb）的DNA拼接組裝方法，再到強大的基因組編輯工具，底盤細胞也因工具的不斷創(chuàng)新得到了快速發(fā)展。微生物最小基因組的分析以及對基因組的連續(xù)刪簡優(yōu)化，為構(gòu)建一個具有可預(yù)測、可控制表型的優(yōu)良底盤細胞奠定了基礎(chǔ)，為促進基于細胞療法的人類疾病治療，哺乳動物細胞作為底盤細胞也正在開發(fā)中。[3]因此，要較好的消化理解這些全新的實驗技術(shù)，理解和掌握合成生物學(xué)最核心的工程化、標準化理念，光靠紙上談兵顯然是不行的，因此，我們反復(fù)討論了植物合成生物學(xué)課程實驗的設(shè)計方案，對實驗教學(xué)內(nèi)容進行精心設(shè)計，力求在較短學(xué)時數(shù)內(nèi)完成從轉(zhuǎn)錄單位的構(gòu)建，多個轉(zhuǎn)錄單位的組裝及在模式植物中的表達與檢測的實驗流程。

合成生物學(xué)是生物技術(shù)在分子生物學(xué)和基因工程層面上的自然延伸，可以說，基因工程和合成生物學(xué)是生物技術(shù)發(fā)展的兩個階段，前者是后者的基礎(chǔ)。但二者并沒有明確的界線，有相當(dāng)一部分內(nèi)容是重疊的。[4]因此，我們在設(shè)計實驗課程時注意到了與分子生物學(xué)實驗課程的關(guān)系，避免重復(fù)性教學(xué)。在基因工程的實施過程中一般只轉(zhuǎn)移個別外源基因，而合成生物學(xué)通常是轉(zhuǎn)移一組基因，涉及到代謝途徑甚至代謝網(wǎng)絡(luò)等。合成生物學(xué)的核心理念是標準化、系統(tǒng)化、工程化。它遵循標準化-設(shè)計-建模/模擬-實施-測試的工程學(xué)思想。合成生物學(xué)家力圖通過工程化的方法，將復(fù)雜的生物系統(tǒng)合理簡化拆分為各個功能元件，通過對生物元件的逐級組裝，直至設(shè)計和構(gòu)建具有嶄新功能的合成生物系統(tǒng)。[5]

傳統(tǒng)的多基因克隆系統(tǒng)往往涉及繁雜的克隆操作，基于IIs型限制性內(nèi)切酶建立的克隆系統(tǒng)（如Golden Gate 、[6]Moclo、 [7]Golden Braid）[8-9]則具有獨特的優(yōu)勢。[10]傳統(tǒng)克隆方法所使用的II型限制性內(nèi)切酶識別和切割回文序列（例如內(nèi)切酶HindIII識別和切割A(yù)AGCTT）。而IIs型限制性內(nèi)切酶識別的一般為非回文序列，切割反應(yīng)在識別位點以外進行?；贗Is型內(nèi)切酶的克隆方法就是在同一反應(yīng)體系中，利用IIs型限制性內(nèi)切酶在識別位點之外切開DNA的特性，產(chǎn)生符合設(shè)計者要求的粘性末端，最后通過連接酶將多個片段按設(shè)計要求“無縫”拼接成不含酶識別位點的DNA。本課程實驗選用了已經(jīng)在植物合成生物學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛采用的西班牙植物分子與細胞生物學(xué)研究所（IBMCP）Diego Orzaez教授實驗室所建立的GoldenBraid系統(tǒng)。GoldenBraid系統(tǒng)是一種模塊化的組裝系統(tǒng)，對于啟動子、編碼序列、終止子等組件（GBparts）賦予不同的首尾部標記，通過兩種IIs型限制性內(nèi)切酶（BsaI和BtgzI）的交叉使用，GoldenBraid系統(tǒng)可以實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄單位在兩類載體中（LEVEL%Z和LEVEL%R載體）的來回組裝以致無窮（類似于“編織”，固命名“Braid”），而僅僅取決于載體的容量。另一方面，由于有多種預(yù)制組件（如啟動子，終止子，報告基因等）可以使用，大大減少了多基因組裝所需的工作量。同時Diego Orzaez教授實驗室也開發(fā)了網(wǎng)頁工具可以在線輔助GoldenBraid組裝（https：//gbcloning.upv.es/）。

因為熒光蛋白轉(zhuǎn)化植物后，易于觀察。本課程實驗選用熒光蛋白基因（DsRed和GFP）作為操作對象，從內(nèi)化、多部分組裝、雙向組裝到轉(zhuǎn)化植物，整個課程實驗包括4個單元，共24學(xué)時。

（1）內(nèi)化實驗（domostication）：將DNA構(gòu)件（稱為GBpart或GBSpart）連入GoldenBraid2.0語法的過程稱為內(nèi)化。內(nèi)化過程通常包括使用GB引物做PCR擴增目的DNA（詞或者詞組）以及將PCR產(chǎn)物通過BsmBI限制-連接反應(yīng)連入pUPD2載體。如果目的DNA內(nèi)部含有BsaI、BsmBI及BtgZI識別位點，還應(yīng)通過PCR反應(yīng)來去除上述酶切位點。我們內(nèi)化的是DsRed基因和GFP基因。

（2）multipartite assembly：多部件組裝，將DNA構(gòu)件（熒光蛋白基因）連入pUPD2后，還需將其與啟動子及終止子組成轉(zhuǎn)錄單位（transcription unit， TU）。選擇符合語法（前后綴匹配）的GB parts，通過BsaI或BtgZI/BsmBI酶切-連接，可將各個構(gòu)件分別連入目標載體（destination vector， pDGB）pDGB alpha或pDGB omega，組裝為pDGB1alpha1-35s_GFP_Tnos（TU1）和pDGB1alpha2-35s_DsRed_Tnos（TU2）。

（3）二元組裝：本課程實驗是要在煙草中同時表達紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白，因此還需要將第2個實驗單元組裝的轉(zhuǎn)錄單位進一步組裝在一起。如果要組裝多個轉(zhuǎn)錄單位，可以通過兩兩組裝的方式來進行。通過BsaI酶切-連接，可將上述兩個轉(zhuǎn)錄單位組裝入pDGB1omega1載體，構(gòu)建為pDGB1omega1_TU1：TU2。如果需繼續(xù)組裝第3個轉(zhuǎn)錄單位，須將TU3連入pDGB1omega2 （pDGB1 omega 2_TU3）。通過BsmBI酶切-連接，在一個試管內(nèi)加入pDGB1omega1_TU1：TU2、pDGB1omega2_TU3及pDGB1alpha1，則組裝為pDGB1alpha1_TU1：TU2：TU3，以此類推可一直組裝下去。

（4）轉(zhuǎn)化植物：由于pDGB1是基于pGreenII骨架構(gòu)建的，所以pDGB1omega1_TU1：TU2可以直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（c58（pSoup）），然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式，采用注射法轉(zhuǎn)化本生煙草（Nicotiana benthamiana）葉片。需在實驗前提前一個月左右安排學(xué)生播種煙草，以便到時有煙草可以使用。一般轉(zhuǎn)化1周后，可以觀察到紅色熒光蛋白的表達，通過手持式紫外燈還可以觀察到GFP的表達。

21世紀是生命科學(xué)的時代，而生命科學(xué)轉(zhuǎn)化為實用技術(shù)最有前途的橋梁之一就是合成生物學(xué)。我國正處于建設(shè)創(chuàng)新型國家的關(guān)鍵時期，合成生物學(xué)等高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展在國民經(jīng)濟的發(fā)展中毫無疑問將起到重要的作用。我國在合成生物學(xué)領(lǐng)域的起步比西方發(fā)達國家晚，但近年進步極快。很多高校都開設(shè)了合成生物學(xué)相關(guān)的課程，相信隨著我國在合成生物學(xué)領(lǐng)域人才培養(yǎng)體系的不斷完善，越來越多的優(yōu)秀科技創(chuàng)新人才會走上崗位，極大推動我國的合成生物學(xué)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本文對我校建設(shè)植物合成生物學(xué)課程實驗的探索做了介紹，學(xué)生們普遍反響收獲很大。合成生物學(xué)實驗教學(xué)體系應(yīng)堅持以培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力為出發(fā)點，通過嚴謹科學(xué)的態(tài)度和扎實細致的工作，最終形成卓有成效的合成生物學(xué)領(lǐng)域創(chuàng)新人才培養(yǎng)模式，為建設(shè)創(chuàng)新型國家培養(yǎng)大批科技創(chuàng)新人才。

參考文獻

[1] D. G. Gibson， J. I. Glass， C. Lartigue， V. N. Noskov， R. Y. Chuang， M. A. Algire， G. A. Benders， M. G. Montague， L. Ma， M. M. Moodie， C. Merryman， S. Vashee， R. Krishnakumar， N. Assad-Garcia， C. Andrews-Pfannkoch， E. A. Denisova， L. Young， Z. Q. Qi， T. H. Segall-Shapiro， C. H. Calvey， P. P. Parmar， C. A. Hutchison， 3rd， H. O. Smith， and J. C. Venter， Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science， 2010. 329（5987）：p.52-6.

[2] C. A. Hutchison， 3rd， R. Y. Chuang， V. N. Noskov， N. Assad-Garcia， T. J. Deerinck， M. H. Ellisman， J. Gill， K. Kannan， B. J. Karas， L. Ma， J. F. Pelletier， Z. Q. Qi， R. A. Richter， E. A. Strychalski， L. Sun， Y. Suzuki， B. Tsvetanova， K. S. Wise， H. O. Smith， J. I. Glass， C. Merryman， D. G. Gibson， and J. C. Venter， Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science， 2016.351（6280）：p.aad6253.

[3] 李雷，姜衛(wèi)紅，覃重軍，薛小莉，蘆銀華.合成生物學(xué)使能技術(shù)的研究進展.中國科學(xué)：生命科學(xué)，2015（10）.

[4] 張春霆.合成生物學(xué)研究的進展.中國科學(xué)基金，2009.23（2）：65-69.

[5] 張柳燕，常素華，王晶.從首個合成細胞看合成生物學(xué)的現(xiàn)狀與發(fā)展.科學(xué)通報，2010.55（36）：3477-3488.

[6] C. Engler， R. Kandzia， and S. Marillonnet， A one pot， one step， precision cloning method with high throughput capability. PLoS One，2008.3（11）：p.e3647.

[7] E. Weber， C. Engler， R. Gruetzner， S. Werner， and S. Marillonnet， A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One，2011.6（2）：p.e16765.

[8] A. Sarrion-Perdigones， E. E. Falconi， S. I. Zandalinas， P. Juarez， A. Fernandez-del-Carmen， A. Granell， and D. Orzaez， GoldenBraid： an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One，2011.6（7）：p.e21622.

[9] A. Sarrion-Perdigones， M. Vazquez-Vilar， J. Palaci， B. Castelijns， J. Forment， P. Ziarsolo， J. Blanca， A. Granell， and D. Orzaez， GoldenBraid 2.0：a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology.Plant Physiol，2013.162（3）：p.1618-31.

[10] N.J.Patron，DNA assembly for plant biology： techniques and tools.Curr Opin Plant Biol，2014.19：p.14-9.