超重/肥胖人群生物樣本庫(kù)的建立及管理

王暉 李曉東 吳輝坤 任朦 梁海莉 汪婷 陶軍秀

肥胖是由于能量攝入與能量消耗失衡所導(dǎo)致的體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)多堆積，是當(dāng)今全球普遍性的公共健康問(wèn)題[1]。隨著生活水平的提高，超重/肥胖人群的發(fā)病率越來(lái)越高[2]，肥胖與多種慢性非傳染性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[3-6]，控制超重/肥胖的發(fā)病率是全球普遍關(guān)注的問(wèn)題。課題組與華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院合作項(xiàng)目“中醫(yī)體質(zhì)辨識(shí)與肥胖人群相關(guān)性研究”，對(duì)1451例超重/肥胖人群進(jìn)行篩查體檢，并建立了具有中醫(yī)特色的超重/肥胖人群生物樣本庫(kù)。生物樣本庫(kù)，又稱生物銀行（biobank），主要是指標(biāo)準(zhǔn)化收集、處理、儲(chǔ)存和應(yīng)用健康與疾病生物體的生物大分子、細(xì)胞、組織和器官等樣本，包括人體器官、全血及血液成分（血漿、血清、白細(xì)胞、紅細(xì)胞等）、核酸（DNA、RNA）、生物體液以及與這些樣本相關(guān)的臨床、病理、治療、隨訪、知情同意等資料及其質(zhì)量控制、信息管理與應(yīng)用系統(tǒng)[7]。生物樣本庫(kù)建設(shè)是臨床醫(yī)學(xué)研究的基石[8]。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

通過(guò)招募方式招募于2016年10—11月在湖北省中醫(yī)院肝病研究型門診進(jìn)行體檢的志愿者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）居住在武漢市的居民；（2）年齡在20～59歲之間；（3）BMI≥24 kg/m2的人群；（4）自愿簽署樣本捐獻(xiàn)知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）器質(zhì)性心臟病或心律失常者；（2）肝腎功能不正常者；（3）妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性或哺乳期婦女；（4）過(guò)敏體質(zhì)者。本生物樣本庫(kù)通過(guò)了湖北省中醫(yī)院倫理委員審查，所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書(shū)。

1.2 儀器設(shè)備

-80 °超低溫冰箱（panasonic MDF-U7386S，Haier DW-86L626），醫(yī)用冰箱（BIOBASE，BDF-25V27ORF），離心機(jī)（cence TDZ5-WS），美國(guó)BRADY（貝迪）標(biāo)簽打印機(jī)和低溫標(biāo)簽。

1.3 研究方法

由專業(yè)招募受試者公司通過(guò)社區(qū)居委會(huì)發(fā)放超重/肥胖體檢通知及體檢條件，預(yù)約符合超重/肥胖體檢要求的受檢者按預(yù)約日期分時(shí)段（7：30和9：00）到達(dá)檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)。

1.3.1 基本信息的采集 清晨空腹?fàn)顟B(tài)下使用統(tǒng)一校正過(guò)的器械按標(biāo)準(zhǔn)流程測(cè)量受檢者身高、體質(zhì)量、腰圍、臀圍，計(jì)算身體質(zhì)量指數(shù)（BMI），計(jì)算公式：BMI=體質(zhì)量（kg）/身高2（m2），BMI≥24 kg/m2的受檢者，統(tǒng)一由同濟(jì)公共衛(wèi)生學(xué)院教授指導(dǎo)在讀研究生/博士生進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查。問(wèn)卷內(nèi)容包括一般個(gè)人情況、居住生活條件、職業(yè)史、患病史和家族疾病病史、用藥史、生活方式評(píng)估、聽(tīng)力相關(guān)癥狀評(píng)估、過(guò)敏與咳嗽咳痰、耳鳴和眩暈等情況、女性健康評(píng)估等。

1.3.2 樣本的采集與保存 樣本采集流程圖見(jiàn)圖1。囑受檢者禁食12 h，晨起在檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)空腹抽肘靜脈血并留取晨尿2管，10 mL/管（女性月經(jīng)期除外），由3名受過(guò)專業(yè)訓(xùn)練的護(hù)士采集每位受檢者全血樣本10 mL（普通管3mL一管；帶分離膠管3mL一管；EDTA抗凝管2管，2 mL/管）。其中普通管送生化室檢測(cè)生化指標(biāo)，EDTA抗凝管1管送臨床室檢測(cè)血常規(guī)；其余2管由生物樣本庫(kù)3名專職人員離心分裝，血樣本靜置1～2 h離心，帶分離膠管3 500 r/min 離心 10 min，分裝凍存管 2 管（0.5 mL/管）；EDTA 抗凝管 3 500 r/min 離心 5 min，取血漿 0.5 mL 一管，紅細(xì)胞 2 管（0.5 mL/管）；血樣本于樣本采集8 h內(nèi)完成分裝并存入-80°冰箱。尿樣本送檢驗(yàn)科1管查尿常規(guī)，一管于采集1 h內(nèi)2 500 r/min離心10 min，分裝3管，2 mL/管；尿樣本于樣本采集2 h內(nèi)完成分裝并存入-80°冰箱。所有樣本均在生物安全柜中分裝，并通過(guò)凍存管條碼上的項(xiàng)目ID與樣本采集管上標(biāo)記的ID對(duì)應(yīng)。

圖1 樣本采集流程圖

1.3.3 檢測(cè)項(xiàng)目 （1）基本體檢：血壓、心肺聽(tīng)診、心電圖、腹部B超；（2）生化指標(biāo)：由檢驗(yàn)科專業(yè)技師集中測(cè)定ALT、AST、GGT、ALP、TBIL、DBIL、ALB、BUN、CR、GLS、TG、CHOL、HDL-C、LDL-C、血常規(guī)、尿常規(guī)、糞常規(guī)；（3）中醫(yī)體質(zhì)辨識(shí)（上海道生醫(yī)療科技有限公司，DS01-A）、中醫(yī)舌診圖像處理專家系統(tǒng)（北京普利生儀器有限公司，TID-2000）、肝臟硬度無(wú)創(chuàng)檢測(cè)（深圳市一體醫(yī)療科技有限公司HEpatest，ET-CD-Ⅱ）和人體成分分析（韓國(guó) Biospace Co.，Ltd，InBody 770）。

1.4 生物樣本庫(kù)的信息化管理

（1）編碼規(guī)則： 規(guī)律的編碼便于樣本查詢，本課題樣本編碼規(guī)則：年+TJ+流水號(hào)+樣本類型+分管號(hào)（樣本類型以英文字母代替），每份樣本均設(shè)置2個(gè)瓶簽，凍存管蓋上小園標(biāo)簽標(biāo)記“二維碼+項(xiàng)目ID”；瓶身長(zhǎng)型標(biāo)簽顯示：樣本編碼規(guī)則內(nèi)容+項(xiàng)目類型+二維碼+項(xiàng)目ID+采樣日期；（2）樣本信息預(yù)錄入：根據(jù)預(yù)約人數(shù)，提前一天按編碼規(guī)則進(jìn)行樣本信息預(yù)錄入，打印樣本條碼，平整黏貼在凍存管上，黏貼好條碼的凍存管按規(guī)律擺放整齊備用。（3）生物樣本相關(guān)數(shù)據(jù)的信息化管理：使用上海萬(wàn)格科學(xué)器材有限公司的樣本庫(kù)凍存管理軟件，美國(guó)BRADY（貝迪）標(biāo)簽打印機(jī)和低溫標(biāo)簽，對(duì)樣本實(shí)行條碼掃描存儲(chǔ)，對(duì)樣本捐獻(xiàn)者的基本信息、檢測(cè)結(jié)果、問(wèn)卷內(nèi)容和樣本信息進(jìn)行規(guī)范化的錄入，使存儲(chǔ)的每一份樣本都對(duì)應(yīng)著詳細(xì)的臨床病歷信息。（4）生物樣本信息安全管理：尊重樣本捐獻(xiàn)者隱私，樣本只涉及編碼，不涉及樣本的個(gè)體信息。個(gè)體信息是科學(xué)研究的重要組成部分，信息安全尤其重要，工作人員現(xiàn)場(chǎng)采集的受檢者信息和數(shù)據(jù)由專人維護(hù)管理，并對(duì)訪問(wèn)數(shù)據(jù)庫(kù)人員設(shè)置權(quán)限，生物樣本信息和受檢者信息分屬不同權(quán)限人員管理，所有計(jì)算機(jī)均設(shè)置密碼口令。

2 結(jié)果

2.1 樣本收集情況

共 納 入 24 kg/m2≤ BMI＜ 28 kg/m2的 超 重 病 例 725 人，BMI≥28 kg/m2的肥胖病例726人，共計(jì)1 451例，男597例，女854例，平均年齡26.79歲，年齡區(qū)間分布見(jiàn)圖2，中醫(yī)體質(zhì)分布見(jiàn)表1。共收集樣本11 530份，其中血清2 902份，全血1 451份、紅細(xì)胞2 902份，血漿1 451份，尿4 176份，糞99份。

圖2 超重/肥胖病例年齡區(qū)間分布（1人未填寫(xiě)年齡）

2.2 樣本質(zhì)量控制

表1 超重/肥胖病例中醫(yī)體質(zhì)分布（1人未填寫(xiě)年齡）

從現(xiàn)存樣本中隨機(jī)抽取保存期半年的樣本，由第三方實(shí)驗(yàn)室（深圳承啟生物科技有限公司）提取RNA，RNA提取方法：250 μL 血清中加入 1 mL Trizol吹打裂解，室溫靜置 5 min；加200 μL 氯仿，劇烈振蕩 30 s，靜置 10 min；4℃，12 000 g 離心10 min，吸取上清400 μL，加入400 μL異丙醇，混勻，靜置10 min；4℃，12 000 g 離心 10 min，去上清，加入 1 mL 75% 乙醇；4℃，12 000 g離心10 min，重復(fù)上一步；去酒精，晾干，加入20 μL dd水溶解。送檢的79份樣本，有77份樣本首次抽提RNA濃度高于15 ng/μl，成功率為97.47%，達(dá)到建庫(kù)測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)。后續(xù)質(zhì)控顯示所提取RNA完整性良好，滿足相關(guān)科研實(shí)驗(yàn)需求。

3 討論

我國(guó)超重和肥胖人口數(shù)量逐年增加，帶來(lái)巨大的健康風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)慢病的發(fā)病率與日俱增，已經(jīng)成為危害我國(guó)國(guó)民健康的頭號(hào)威脅[9]。2010年的研究顯示，我國(guó)成人超重率一直以每年3%的速度上升，肥胖以每年6%以上的速度上升，肥胖增長(zhǎng)速度高于當(dāng)時(shí)世界平均水平，2012年我國(guó)成人超重率為30.1%，肥胖率為11.9%[10]。隨著肥胖率的升高，人們對(duì)超重/肥胖的關(guān)注和研究也越來(lái)越多，現(xiàn)有的研究表明，肥胖是導(dǎo)致胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、高血脂、脂肪肝以及癌癥的危險(xiǎn)因素之一[3-6，11]。因此，探索尋找有效的控制超重/肥胖的發(fā)病率成為研究人員工作的重點(diǎn)。近年來(lái)隨著人類基因組計(jì)劃的完成，研究人員認(rèn)為，現(xiàn)代肥胖者增多與個(gè)體的遺傳易感性有關(guān)，肥胖的發(fā)病是多因素綜合作用的結(jié)果，其中起決定性作用的是遺傳因素[12]。

人體生物樣本庫(kù)在國(guó)外已有多年的歷史，我國(guó)正常與疾病生物樣本庫(kù)建設(shè)尚處于初期階段，普遍存在條塊分割、相互封閉，收集不規(guī)范，缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化流程、質(zhì)控體系、安全保障體系與信息化管理系統(tǒng)等問(wèn)題[13]，最早的生物樣本庫(kù)是于1994年中國(guó)科學(xué)院建立的中華民族永生細(xì)胞庫(kù)[14]，目前針對(duì)超重/肥胖人群的生物樣本庫(kù)建設(shè)較少見(jiàn)。我院建立的具有中國(guó)特色的采集了中醫(yī)體質(zhì)、舌像的超重/肥胖生物樣本庫(kù)，為超重/肥胖的基礎(chǔ)和臨床研究奠定了基礎(chǔ)，為后續(xù)研究其發(fā)生發(fā)展、變化趨勢(shì)和治療提供高質(zhì)量的樣本資源，全面分析肥胖的遺傳變異因素，與中醫(yī)體質(zhì)結(jié)合，對(duì)制定超重/肥胖的預(yù)防和控制措施，改善人民健康，促進(jìn)全國(guó)中醫(yī)院資源流通與共享，為中醫(yī)藥走出國(guó)門貢獻(xiàn)力量[15]。