外周血紅細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)老年認(rèn)知障礙的診斷價(jià)值

呂慶坤，黃高忠，陳婕，黃梅珍，杜冬梅，張倩*

(1上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院特需醫(yī)療科，上海 200030；2上海市閔行區(qū)江川社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 200240；3上海交通大學(xué)儀器科學(xué)與工程系，上海 200240)

對(duì)于阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的診斷，臨床上普遍應(yīng)用的是神經(jīng)心理量表，其對(duì)輕度認(rèn)知障礙(mild cognitive impairment,MCI)敏感性低，并受到臨床醫(yī)師主觀影響[1]。

拉曼光譜被認(rèn)為是分子的“指紋”，可反映物質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)信息。許多生物分子具有拉曼活性，呈現(xiàn)出明顯的光譜峰位和強(qiáng)度特征，這些光譜特征反映了組織正常或疾病狀態(tài)下的分子信息。上海交通大學(xué)光譜檢測(cè)與儀器實(shí)驗(yàn)室對(duì)糖尿病患者的尿液[2]以及骨髓瘤患者的血液[3]進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)檢測(cè)與分析，獲得了理想的區(qū)分效果。

Kosenko等[4]認(rèn)為AD的主要啟動(dòng)機(jī)制可能是紅細(xì)胞內(nèi)能量代謝紊亂。AD患者紅細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力長(zhǎng)期慢性代償性增強(qiáng)引起三磷酸腺苷和2,3-二磷酸甘油酸水平升高，使血紅蛋白對(duì)氧的親和力增強(qiáng)，不易解離，腦組織氧供給不足，最終導(dǎo)致認(rèn)知下降[5]。紅細(xì)胞膜在氧化應(yīng)激下受損，使其在毛細(xì)血管中轉(zhuǎn)移能力受到影響，進(jìn)而導(dǎo)致血液流變學(xué)的異常，加重了組織氧供給不足[6]。我們推測(cè)AD患者血漿中紅細(xì)胞成分的改變可能在拉曼光譜上表現(xiàn)出特異改變，嘗試通過(guò)SERS技術(shù)將其顯現(xiàn)，并進(jìn)一步探索其對(duì)不同程度老年認(rèn)知障礙患者的診斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

共計(jì)62例患者納入本研究。所有患者及家屬知情并同意進(jìn)行相關(guān)神經(jīng)心理學(xué)量表測(cè)定，包括：簡(jiǎn)易智能精神狀態(tài)檢查(mini-mental state examination,MMSE)量表、北京版蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(Montreal cognitive assessment scale,MOCA)、臨床癡呆量表(clinical dementia rating scale,CDR)、總體衰退量表(global deterioration scale,GDS)、14項(xiàng)版本日常生活活動(dòng)能力量表(activities of daily living scale,ADL)、Hachinski缺血量表(Hachinski ischemic score,HIS)等。受教育時(shí)間≤12年者，以MMSE作為篩查工具；受教育時(shí)間≥13年者，以MOCA作為篩查工具。符合Petersen等2001年提出的MCI診斷標(biāo)準(zhǔn)者，結(jié)合量表評(píng)估納入MIC組(n=23)；符合美國(guó)精神病學(xué)會(huì)精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 5th edition,DSM-V)中AD診斷標(biāo)準(zhǔn)者，結(jié)合量表評(píng)估納入AD組(n=16)。其余23例納入認(rèn)知功能正常對(duì)照組。

排除標(biāo)準(zhǔn)：任何引起癡呆的其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括帕金森病、癲癇、腦外傷等；既往2年內(nèi)患抑郁癥，或符合DSM-V的其他精神疾病；既往2年內(nèi)有酒精、藥物濫用或依賴(lài)史；任何血液系統(tǒng)疾病；任何顯著的系統(tǒng)性疾病或不穩(wěn)定醫(yī)學(xué)情況，包括系統(tǒng)紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、急性心功能衰竭、神經(jīng)梅毒等；前2周內(nèi)使用過(guò)影響腦功能的藥物。

各組基線數(shù)據(jù)比較中，3組性別、年齡、教育年限、共存疾病構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；表1)；血常規(guī)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,3組間各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；表2)。

1.2 研究方法

本研究采用問(wèn)卷調(diào)查方法記錄入選對(duì)象年齡、學(xué)歷等人口學(xué)資料情況；根據(jù)病例住院期間臨床資料獲取患者基礎(chǔ)疾病,實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。調(diào)查前調(diào)查員進(jìn)行統(tǒng)一培訓(xùn)；調(diào)查時(shí)調(diào)查員對(duì)入選對(duì)象進(jìn)行一對(duì)一調(diào)查；所有資料由雙人錄入。

入選病例的外周靜脈血液經(jīng)離心方法得到紅細(xì)胞，-80℃儲(chǔ)藏。取10 μl紅細(xì)胞樣本與10 μl銀納米顆?；旌?；將混合物轉(zhuǎn)移至潔凈的鋁板靜置待測(cè)。使用上海交通大學(xué)光譜檢測(cè)與儀器實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的便攜式拉曼光譜儀Hx-Spec進(jìn)行拉曼光譜測(cè)量,激發(fā)光波長(zhǎng)785 nm，測(cè)量范圍200～2 700/cm，分辨率6/cm；激發(fā)光功率100 mW，積分時(shí)間5 s，每個(gè)樣本取3次拉曼光譜平均值。對(duì)所采集的光譜利用五階擬合等方式去除樣本的熒光散射背景，光譜數(shù)據(jù)歸一化以減少誤差。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 各組一般情況匯總

NC: normal control; MCI: mild cognitive impairment; AD: Alzheimer disease; HTN: hypertension; DM: diabetes mellitus; CHD: coronary heart disease.

2 結(jié) 果

2.1 各組紅細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜及其判別

我們以拉曼位移為橫坐標(biāo)，相對(duì)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制各組紅細(xì)胞標(biāo)本拉曼光譜圖(圖1)。

從光譜中選出相對(duì)強(qiáng)度差異明顯的拉曼位移值479.7，719.8，1 126.8，1 219.4，1 334.1，1 438.1，1 582.4/cm。對(duì)應(yīng)拉曼位移處的相對(duì)強(qiáng)度分別用I1,I2,I3,I4,I5,I6,I7表示。

2.2 紅細(xì)胞光譜拉曼位移主要?dú)w屬

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]，確定所取拉曼位移相對(duì)應(yīng)的化學(xué)鍵及所可能歸屬的生物分子如表3所示。

2.3 紅細(xì)胞光譜數(shù)據(jù)對(duì)疾病的診斷能力

為充分利用光譜數(shù)據(jù)，取上述拉曼位移處兩兩強(qiáng)度的比值，進(jìn)行逐步判別分析，得到判別函數(shù)并交叉驗(yàn)證其靈敏度及特異度。結(jié)果提示I1/I3(x1)，I3/I5(x2)能夠最有效率地區(qū)分各組(表4)。

典型判別函數(shù)主要用于考察各類(lèi)別中個(gè)體之間的關(guān)系。我們用典型判別函數(shù)得到不同y值，可以作為區(qū)分各組的新指標(biāo)。經(jīng)ROC檢驗(yàn)得出相應(yīng)的ROC曲線下面積(area under the curve,AUC)及相應(yīng)的靈敏度和特異度(表5；圖2)。

表2 各組實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)比較

NC: normal control; MCI: mild cognitive impairment; AD: Alzheimer disease; WBC: white blood count; HGB: hemoglobin; MCV: mean corpuscular volume; MCH: mean corpuscular hemoglobin; MCHC: mean corpuscular hemoglobin concentration; RDW: red cell distribution width; Hct: hematocrit.

圖1 各組紅細(xì)胞SERS

Ramanshift(1/cm)Vibration model Major assignments 479.7γ12Porphyrin ring719.8δ(COO-)Globin, cellular constituent(amino acids)1 126.8=C2vinylH,υ(Cβ-methyl),υ(C-N)Heme, porphyrin ring, pyrrole ring, lipid1 219.0δ(CmH)Porphyrin ring1 334.1υ(Pyrhalf-ring) asymδ(CH), w(CH3)Porphyrin ring,cellular constituent(proteins)1 582.4υ(CαCm)asym,υ37Heme, porphyrin ring, cellular constituent(phenylalanine,tyrosine)

SERS: surface-enhanced Raman spectroscopy; υ: stretching vibration; δ: bending vibration; w: rocking vibrations.

表4 兩兩之間紅細(xì)胞拉曼光譜數(shù)據(jù)判別結(jié)果

NC: normal control; AD: Alzheimer disease; MCI: mild cognitive impairment.

表5 紅細(xì)胞光譜診斷方法ROC檢驗(yàn)結(jié)果

ROC: receiver operating characteristic; SERS: surface-enhanced Raman spectroscopy; NC: normal control; AD: Alzheimer disease; MCI: mild cognitive impairment.

圖2 兩組間y值的受試者工作特征曲線

3 討 論

在對(duì)AD的不斷探索中,研究者們發(fā)現(xiàn)AD患者外周血液發(fā)生了一系列的生理病理改變。一些生化標(biāo)志物被相繼提出，期望能有助于AD的診斷、治療及隨訪觀察。但是，在AD的診斷方面，這些生化標(biāo)志物的權(quán)重大小、特異度和敏感度高低以及各自相互間如何作用等問(wèn)題還有待進(jìn)一步探討[10]。

目前將SERS應(yīng)用于AD患者紅細(xì)胞病理改變的研究并不多見(jiàn)。SERS檢測(cè)技術(shù)可以觀察到β-淀粉樣蛋白40(amyloid β-protein 40,Aβ40)在結(jié)合細(xì)胞膜脂質(zhì)模型時(shí)構(gòu)像發(fā)生變化[11]。亦有研究發(fā)現(xiàn)Aβ與紅細(xì)胞膜結(jié)合能夠抑制細(xì)胞膜乙酰膽堿酯酶和蛋白激酶及細(xì)胞內(nèi)某些能量代謝相關(guān)酶的活性，干擾能量代謝過(guò)程，介導(dǎo)紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，最終導(dǎo)致紅細(xì)胞死亡[12,13]。而且Aβ25～35誘發(fā)的小鼠AD模型中紅細(xì)胞發(fā)生變異，已有研究人員應(yīng)用顯微拉曼光譜儀檢測(cè)技術(shù)得到了特異的光譜信號(hào)[6]。

我們對(duì)紅細(xì)胞SERS進(jìn)行分析，同樣發(fā)現(xiàn)AD組與對(duì)照組、MCI組間的光譜差異明顯。這些拉曼位移強(qiáng)度的差異主要指向血紅蛋白內(nèi)血紅素、卟啉環(huán)、吡咯環(huán)中的分子鍵震動(dòng)模型的變化，這也可能驗(yàn)證了前文所述的紅細(xì)胞輸氧能力的改變。另外，在AD患者大腦皮質(zhì)尸檢中發(fā)現(xiàn)老年斑中同時(shí)富含血紅素的沉積物，腦脊液中亞鐵血紅素的氧化活性增強(qiáng)，因?yàn)锳β與血紅素結(jié)合的復(fù)合物能夠表現(xiàn)出過(guò)氧化物酶的活性[14]。這些可能證明了紅細(xì)胞及其成分確實(shí)參與了AD病理生理變化。

但是，細(xì)胞SERS的差異在分辨3組病例時(shí)的準(zhǔn)確性不夠理想，對(duì)AD的診斷價(jià)值還有待我們進(jìn)一步挖掘。我們分析原因歸結(jié)如下。首先，紅細(xì)胞由細(xì)胞膜、血紅蛋白及復(fù)雜多樣的細(xì)胞器組成。在樣本準(zhǔn)備及檢測(cè)過(guò)程中，細(xì)胞完整性受到了破壞，細(xì)胞組分間相互作用的產(chǎn)物可能掩蓋了原有的光譜特征。其次，血紅蛋白容易受到周?chē)h(huán)境中氧化物質(zhì)的氧化影響，作為紅細(xì)胞主要組成部分對(duì)光譜有較大影響。不同酸堿度[15]、氧化[8]、金屬膠體顆粒的毒性[7]以及所用基片[16]和入射光波長(zhǎng)[17]等條件對(duì)紅細(xì)胞拉曼光譜特征都有影響。第三，本研究使用的樣本為離心后紅細(xì)胞沉淀，細(xì)胞膜完整性破壞，與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)形成混合物，SERS技術(shù)可能不能很好地展示其光譜特點(diǎn)。今后，我們擬利用紅細(xì)胞與銀膠體顆粒孵化的技術(shù)來(lái)保證紅細(xì)胞的完整性及部分生理特點(diǎn)，以便于觀察細(xì)胞膜的及細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的光譜變化。

總之，拉曼光譜技術(shù)所檢測(cè)光譜信號(hào)正是混合物中各成分信號(hào)的總和，其應(yīng)用在AD紅細(xì)胞中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因?yàn)镾ERS能整體上反映研究對(duì)象的變化，可對(duì)疾病的病理變化進(jìn)行全面分析，對(duì)AD這類(lèi)機(jī)制復(fù)雜不清的全身性疾病的診斷可能有所裨益。