人尿源干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及體外成神經(jīng)細(xì)胞分化研究

姜之歆，王從容

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，上海市糖尿病研究所，上海市糖尿病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市糖尿病臨床醫(yī)學(xué)中心，上海 200030)

隨著組織工程相關(guān)研究與日俱增，干細(xì)胞治療越來越被關(guān)注[1,2]。干細(xì)胞自我更新及體外多向分化能力旺盛，可間接分泌多種細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)免疫，常被用來作為治療疾病的種子細(xì)胞，其中用于神經(jīng)細(xì)胞移植療法的主要有胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)、神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)以及其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)[3-5]。ESC取材不易和倫理問題限制了其廣泛應(yīng)用，NSC需自體有創(chuàng)取材，提取與培養(yǎng)均十分不易。目前已有研究證實(shí)骨髓來源的MSC可在體外成功分化為神經(jīng)細(xì)胞[6,7]，在細(xì)胞治療中被廣泛研究。人尿源干細(xì)胞(human urinary stem cells,hUSC)因便于取材、來源簡易、安全無創(chuàng)等特點(diǎn)，臨床應(yīng)用前景廣闊[8-10]。Zhang等[11]首次報道從人尿液中分離獲得一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，并鑒定了其 MSC的生物特性，表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90等MSC標(biāo)志物，并可體外成功分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。目前對hUSC分化為神經(jīng)細(xì)胞的相關(guān)報道較少，且結(jié)果不一。為進(jìn)一步研究hUSC分化為神經(jīng)細(xì)胞(包括NSC、膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞)的可行性，本研究對既往文獻(xiàn)中報道的經(jīng)典MSC成神經(jīng)誘導(dǎo)液，以及hUSC成神經(jīng)誘導(dǎo)液成分做了整合調(diào)整，對hUSC向神經(jīng)類細(xì)胞定向分化潛能進(jìn)行了研究，以期為hUSC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的應(yīng)用提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 hUSC的培養(yǎng)和傳代

我們收集了3例健康成人無菌新鮮中段尿液200 ml，加入5 ml青鏈霉素混勻，分裝至4管50 ml離心管，400轉(zhuǎn)/min離心10 min后棄上清，加入20 ml磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)吹打混勻，繼續(xù)400轉(zhuǎn)/min離心10 min，棄上清，hUSC培養(yǎng)基重懸后接種于0.1%明膠包被的6孔板中(2 ml/孔)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。hUSC培養(yǎng)基成分包括：含F(xiàn)12 Dulbecco改良型基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium/nutrient mixture F-12,DMEM/F12)、2%胎牛血清、10 ng/ml表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)、2 ng/ml血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、1 ng/ml轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)、2 ng/ml重組人成纖維細(xì)胞生長因子(recombinant human fibroblast growth factor,hFGF)、0.5 mmol/L氫化可的松、24 mg/ml胰島素、20 mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、549 ng/ml腎上腺素、125 ng/ml三碘甲狀腺原氨酸。原代細(xì)胞培養(yǎng)3 d后觀察細(xì)胞生長情況，并添加培養(yǎng)基1 ml/孔，經(jīng)7～10 d培養(yǎng)，待hUSC融合率80%～90%時，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)上海市第六人民醫(yī)院倫理委員會審核各項(xiàng)通過。

1.2 hUSC表面標(biāo)志物檢測

選取P4 hUSC，PBS洗滌2遍，加入0.25%胰蛋白酶消化，1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)洗滌后重懸細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至106/ml。取細(xì)胞懸液200 μl加入藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標(biāo)記的單克隆抗體CD29、CD73、CD90、CD34和HLA-DR，以及異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的單克隆抗體 CD44、CD31、CD45至各流式管，并以相應(yīng)的熒光標(biāo)記的IgG抗體為同型對照組。冰上避光孵育30 min, 孵育后200轉(zhuǎn)/min 離心5 min，使用PBS清洗游離抗體，200轉(zhuǎn)/min 再次離心5 min，最終用1%BSA重懸細(xì)胞至200 μl，經(jīng)Guava easyCyte (Millipore, USA)流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 成神經(jīng)分化檢測

取P4代hUSC，以5×104/ml濃度接種于6孔板，待其融合度達(dá)90%～100%時，按預(yù)處理、分化誘導(dǎo)兩個階段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(1)預(yù)處理階段，使用低糖DMEM、10%胎牛血清、100 ng/ml hFGF 預(yù)誘導(dǎo)24 h，之后各孔分別更換成對應(yīng)的誘導(dǎo)液。(2)分化階段采用不同成分的成神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14 d。A成神經(jīng)誘導(dǎo)液是使用經(jīng)典誘導(dǎo)方案[12]：DF-12培養(yǎng)基，添加50 ng/ml hFGF、50 ng/ml EGF、10 ng/ml 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，bDNF)。B成神經(jīng)誘導(dǎo)液參照既往文獻(xiàn)報道的hUSC成神經(jīng)誘導(dǎo)液成分[13]：DF-12培養(yǎng)基，添加50 ng/ml hFGF、50 ng/ml EGF、2% B27神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)添加劑、1% 非必需氨基酸(non-essential amino acids，NEAA)、1% L-谷氨酸、1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(insulin-transferrin-selenium,ITS)溶液。C成神經(jīng)誘導(dǎo)液在經(jīng)典誘導(dǎo)方案(A)基礎(chǔ)上添加了其他促成神經(jīng)分化成分，包括0.1%的二甲基亞砜、0.1 mmol/L丁基羥基茴香醚。D成神經(jīng)誘導(dǎo)液除將DF-12培養(yǎng)基更換為低糖DMEM培養(yǎng)基，其他成分和C成神經(jīng)誘導(dǎo)液相同。對照組不進(jìn)行成神經(jīng)誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)液隔天換液，誘導(dǎo)至第14天時，熒光倒置顯微鏡下觀察各誘導(dǎo)液中細(xì)胞形態(tài)變化。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測

我們檢測了神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物Nestin, 成熟神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物β3-tublin與NF-200，膠質(zhì)細(xì)胞前體特異性標(biāo)志物S100的表達(dá)情況。Trizol法常規(guī)提取細(xì)胞總RNA，cDNA 提取參照Superscript Ⅲ Fast-Strand Synthesis System(Invitrogen) 試劑盒說明。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)參照 Powerup Sybr Green Master Mix (Thermo Fischer Scientific) 反應(yīng)體系，終CT值上機(jī)由LightCycler 480 system測得。引物定量標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)內(nèi)參GAPDH。引物序列由Primer-BLAST 在線設(shè)計獲得，由上海生物工程有限公司合成,正反引物如下(表1)。

表1 Nestin、S100、β3-tublin、NF-200、GAPDH基因引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 hUSC原代培養(yǎng)鑒定

正常人尿液經(jīng)離心、重懸、接種至6孔板后7～10 d開始出現(xiàn)克隆微團(tuán)，貼壁生長(圖1A)。 細(xì)胞緊密排列，形態(tài)均一，呈短梭形或米粒樣，14 d左右克隆融合率達(dá)90%～100%，此時對其進(jìn)行傳代，即得到P1代hUSC(圖1B)。細(xì)胞增殖迅速，經(jīng)多次傳代，細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變(圖1C)。

2.2 hUSC的MSC特性

P4代hUSC表面標(biāo)志物流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果顯示，hUSC高表達(dá)CD29(99.64%)、CD44(97.22%)、CD73(99.44%)、CD90(71.14%)，不表達(dá)CD31(2.66%)、CD34(0.62%)、CD45(2.22%)、HLA-DR(0.60%)，提示其MSC來源具備多向分化潛能 (圖2)。

2.3 hUSC細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞檢測

誘導(dǎo)至第14天時，A成神經(jīng)誘導(dǎo)液中細(xì)胞形態(tài)緊密，未發(fā)現(xiàn)明顯改變(圖 3A)，Nestin、S100、β3-tublin、NF-200基因不表達(dá)(圖 4)。B成神經(jīng)誘導(dǎo)液中細(xì)胞胞體回縮飽滿、折光度變強(qiáng)，呈現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞樣突起(圖 3B)，C成神經(jīng)誘導(dǎo)液中細(xì)胞形態(tài)飽滿，折光度變強(qiáng)(圖 3C)，D成神經(jīng)誘導(dǎo)液中細(xì)胞形態(tài)亦出現(xiàn)類似神經(jīng)細(xì)胞樣改變(圖 3D)。相比A成神經(jīng)誘導(dǎo)液，B、C和D成神經(jīng)誘導(dǎo)液中細(xì)胞Nestin、S100基因表達(dá)水平增高，B和D成神經(jīng)誘導(dǎo)液中細(xì)胞β3-tublin、NF-200基因表達(dá)水平降低。其中C成神經(jīng)誘導(dǎo)液中細(xì)胞Nestin基因表達(dá)水平高于B和D成神經(jīng)誘導(dǎo)液中細(xì)胞，B成神經(jīng)誘導(dǎo)液中細(xì)胞S100基因表達(dá)水平高于C和D成神經(jīng)誘導(dǎo)液中細(xì)胞，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖 4)。

3 討 論

hUSC的來源方式簡易，可對同一供體進(jìn)行多次取材，是理想的自體種子細(xì)胞來源。既往研究中對hUSC體外誘導(dǎo)多能干細(xì)胞后進(jìn)行成神經(jīng)分化研究較多，或是通過轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)源性基因建立hUSC來源的NSC模型，進(jìn)而再向神經(jīng)細(xì)胞分化[12-14]。然而， 直接對hUSC進(jìn)行體外成神經(jīng)分化的研究較少,且結(jié)果不盡一致。Guan等[15]的研究結(jié)果表明hUSC體外成神經(jīng)分化時NSC特異性標(biāo)志物Nestin、Sox2表達(dá)水平增高，而終末成熟神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物如β3-tublin表達(dá)水平未增高,提示hUSC可向神經(jīng)前體細(xì)胞分化。Bharadwaj等[16]的研究表明hUSC體外成神經(jīng)誘導(dǎo)可成功表達(dá)NSC特異性標(biāo)志物Nestin及成熟神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物NF-200，但膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物S100表達(dá)水平未增高，提示特定培養(yǎng)條件下hUSC可向神經(jīng)細(xì)胞定向分化。

圖1 hUSC原代培養(yǎng)

圖2 原代hUSC表面標(biāo)志物流式細(xì)胞術(shù)鑒定

hUSC: human urinary stem cells. hUSC was identified by flow cytometry using the surface markers CD29,CD44,CD73,CD90,CD31,CD34,CD45 and HLA-DR. White solid peaks represent the isotype controls and the grey solid peak represents the marker indicated.

圖3 hUSC 分別在4種成神經(jīng)誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)至第14天時的形態(tài)變化

圖4 hUSC經(jīng)4種成神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)至第14天時Nestin、S100、 β3-tublin、NF-200的相對表達(dá)水平

本研究結(jié)果表明，我們成功從健康成人尿液中提取出hUSC，并鑒定了其MSC來源。在體外成神經(jīng)分化研究中，A成神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)過程中未見任何細(xì)胞形態(tài)改變及神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，可能由于MSC來源不同，該誘導(dǎo)液最多報道用于人臍帶MSC的成神經(jīng)分化[13，17]，可能并不適合用于hUSC。成神經(jīng)誘導(dǎo)液14 d后，B、C、D誘導(dǎo)液中細(xì)胞胞體均出現(xiàn)回縮、折光度增加，呈現(xiàn)類似神經(jīng)樣細(xì)胞的改變，提示開始向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果顯示hUSC經(jīng)過B、C、D成神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14 d后，NSC特異性標(biāo)志物Nestin表達(dá)水平均顯著上調(diào)，其中C成神經(jīng)誘導(dǎo)液中細(xì)胞Nestin表達(dá)水平最高(P<0.05)，提示C成神經(jīng)誘導(dǎo)液最有利于hUSC向NSC分化。B、C、D成神經(jīng)誘導(dǎo)液中膠質(zhì)細(xì)胞前體標(biāo)志物S100表達(dá)量亦均顯著上調(diào)，其中B成神經(jīng)誘導(dǎo)液中細(xì)胞S100表達(dá)水平最高(P<0.05)，提示B成神經(jīng)誘導(dǎo)液最有利于hUSC向膠質(zhì)前體細(xì)胞分化。而成熟神經(jīng)元細(xì)胞特異性標(biāo)志物β3-tublin與NF-200基因在4種成神經(jīng)誘導(dǎo)液中表達(dá)水平未增高，β3-tublin在B、D成神經(jīng)誘導(dǎo)液中反而有所降低。以上結(jié)果初步表明B、C、D成神經(jīng)誘導(dǎo)液均有助于誘導(dǎo)hUSC向神經(jīng)類細(xì)胞分化，分化的細(xì)胞表達(dá)NSC特異性標(biāo)志物Nestin，以及膠質(zhì)細(xì)胞亞群的前體標(biāo)志物S100，但未能形成成熟的神經(jīng)細(xì)胞。

本研究hUSC成功分化為神經(jīng)前體細(xì)胞，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將從神經(jīng)前體細(xì)胞向成熟神經(jīng)細(xì)胞或成熟神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞入手，通過細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、神經(jīng)電生理特性、分子生物學(xué)功能等角度進(jìn)一步驗(yàn)證，hUSC極有可能成為干細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要“種子細(xì)胞”。