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    類葉升麻苷對腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及炎癥因子的影響

    2019-04-25 00:01:58任佳高莉譚雪閆明
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2019年4期
    關(guān)鍵詞:炎癥因子

    任佳 高莉 譚雪 閆明

    摘要:目的? 觀察類葉升麻苷對腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶及炎癥因子的影響,探討其相關(guān)作用機(jī)制。方法? 30只SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組和類葉升麻苷低、高劑量組,每組6只。采用線栓法制作大腦中動脈栓塞慢性缺血再灌注癡呆大鼠模型,通過跳臺、Y迷宮實驗檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,采用流式細(xì)胞儀及ELISA試劑盒測定血清、海馬及皮層中白細(xì)胞介素(IL)-1α、IL-2、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素-γ(IFN-γ)的含量。結(jié)果? Y迷宮實驗結(jié)果顯示:與假手術(shù)組比較,模型組大鼠新異臂進(jìn)入次數(shù)減少,其他臂進(jìn)入次數(shù)增加,新異臂潛伏期增加(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,尼莫地平組和類葉升麻苷低、高劑量組大鼠新異臂進(jìn)入次數(shù)增加,其他臂進(jìn)入次數(shù)減少,新異臂潛伏期減少(P<0.05,P<0.01)。跳臺實驗結(jié)果顯示:與假手術(shù)組比較,模型組大鼠測試期潛伏期減少,犯錯誤次數(shù)增加(P<0.01);與模型組比較,類葉升麻苷低、高劑量組大鼠測試期潛伏期增加,犯錯誤次數(shù)減少(P<0.05,P<0.01);流式細(xì)胞儀及ELISA試劑盒檢測顯示:與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清、海馬和皮層IL-1α、IL-2、TNF含量明顯增加(P<0.05,P<0.01),海馬IFN-γ含量明顯減少(P<0.05);與模型組比較,類葉升麻苷低、高劑量組大鼠血清、海馬和皮層IL-1α、TNF含量明顯降低,血清、海馬IL-2明顯降低(P<0.05,P<0.01),海馬IFN-γ含量明顯增加(P<0.01)。結(jié)論? 類葉升麻苷可提高M(jìn)CAO大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,且可有效降低模型大鼠炎癥因子水平,其對模型大鼠的防治作用可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

    關(guān)鍵詞:類葉升麻苷;缺血再灌注;學(xué)習(xí)記憶功能障礙;炎癥因子

    中圖分類號:R285.5? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A? ? 文章編號:1005-5304(2019)04-0047-05

    血管性癡呆主要是指同腦血管疾病具有關(guān)聯(lián)的癡呆,因腦血管因素而形成了認(rèn)知與智能等功能障礙。類葉升麻苷(Acteoside,AS)又名毛蕊花糖苷、麥角甾苷,是肉蓯蓉中一種水溶性較強(qiáng)的苯乙醇苷類活性成分,具有抗氧化損傷、神經(jīng)保護(hù)、改善記憶、調(diào)節(jié)免疫的作用[1-2]。前期研究發(fā)現(xiàn),AS可顯著改善雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法所致血管性癡呆引起的學(xué)習(xí)記憶功能減退和抑郁情緒障礙,并通過降低血清和腦組織丙二醛(MDA)、活性氧簇(ROS)含量及提高谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性,減少氧化應(yīng)激損傷。因此,本研究采取制作大腦中動脈栓塞慢性缺血再灌注)模型[3-4]模擬血管性癡呆,從學(xué)習(xí)記憶損傷、炎癥因子表達(dá)等方面探究AS對在體動物缺血再灌注所致血管性癡呆的神經(jīng)保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。

    1? 實驗材料

    1.1? 動物

    清潔級雄性SD大鼠50只,體質(zhì)量(360±20)g,購自新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心,動物許可證號SCXK(新)2011-0001。大鼠均飼養(yǎng)于石河子大學(xué)SPF級動物房,溫度20~25 ℃,12 h/12 h光照明暗交替,自由攝食飲水。

    1.2? 主要藥物與試劑

    AS(純度≥98%),本實驗室自制;尼莫地平片,亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,批號170602。

    1.3? 主要試劑與儀器

    大鼠白細(xì)胞介素(IL)-1α高通量液相蛋白定量試劑盒,北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司;大鼠IL-2高通量液相蛋白定量套裝,北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司;大鼠腫瘤壞死因子(TNF)高通量液相蛋白定量套裝,北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司;干擾素-γ(IFN-γ)ELISA測定試劑盒,上海江萊生物有限公司。XR-XY1032 Y迷宮視頻分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司),YLS-3TB跳臺記錄儀(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司),流式細(xì)胞儀、Go1510全波長酶標(biāo)儀(Thermo Fisher),Allegra 64R離心機(jī)(BECKMAN),TL2010S高通量組織研磨儀(SOP-EQ036)。

    2? 實驗方法

    2.1? 造模

    10%水合氯醛腹腔注射300 mg/kg麻醉,去除頸前鼠毛并消毒。沿頸部正中切開,在右側(cè)肩胛舌骨和胸鎖乳突肌形成的三角處,以止血鉗鈍性分離,暴露頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)。結(jié)扎ECA分支枕動脈、甲狀腺上動脈及ECA終末支,分離ICA顱外分支翼腭動脈。將ECA結(jié)扎并剪斷,把ECA遠(yuǎn)心端拉直與ICA成直線,并在分叉處松松結(jié)扎一根4-0絲線。用動脈夾夾閉CCA、ICA,在ECA上剪一小切口。移去CCA上的動脈夾,縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠只分離CCA、ECA和ICA,不插入栓線。MCAO大鼠麻醉清醒后,參照Longa等[5]及Bederon等[6]的5分制評分方法對實驗大鼠的神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評分,2~4分者納入實驗。

    2.2? 分組和給藥

    造模完成后,按照大鼠體質(zhì)量及神經(jīng)行為學(xué)評分雙因素對模型大鼠進(jìn)行篩選分組,選取造模成功大鼠30只。假手術(shù)組6只,將其余造模成功24只大鼠隨機(jī)分為模型組、尼莫地平組(12.5 mg/kg)、AS低劑量組(6.25 mg/ kg)、AS高劑量組(12.5 mg/kg),每組6只。各給藥組予相應(yīng)劑量藥液灌胃,假手術(shù)組和模型組予等體積超純水灌胃。給藥體積0.1 mL/100 g,每日1次,連續(xù)21 d。

    2.3? 行為學(xué)測試

    2.3.1? Y迷宮實驗

    Y迷宮訓(xùn)練:新異臂被隔板擋住,大鼠由起始臂放入,在起始臂和其他臂中自由活動10 min,訓(xùn)練結(jié)束后,大鼠被放回飼養(yǎng)籠。Y迷宮檢測:訓(xùn)練結(jié)束后4 h進(jìn)行,抽開新異臂隔板,大鼠由起始臂放入,在3個臂中自由活動5 min。錄像記錄5 min內(nèi)每只大鼠在各個臂停留的時間和穿梭次數(shù)。統(tǒng)計并分析大鼠在各個臂停留時間占總時間百分比、進(jìn)入次數(shù)及新異臂潛伏期。

    2.3.2? 跳臺實驗

    在開展實驗前,將大鼠放入跳臺儀的反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3 min。跳臺訓(xùn)練:用手抓住大鼠背部放在跳臺箱的平臺上,然后立即通36 V交流電,訓(xùn)練5 min,記錄計時開始至大鼠第1次跳下平臺遭受電擊的時間(潛伏期)及大鼠下臺遭受電擊的次數(shù)(錯誤次數(shù))作為學(xué)習(xí)成績。跳臺測試:訓(xùn)練結(jié)束后24 h測試其記憶能力,記錄潛伏期及即錯誤次數(shù),作為記憶成績。

    2.4? 指標(biāo)測定

    行為學(xué)實驗結(jié)束后,腹主動脈取血,4 ℃、3000 r/min離心15 min,取血清分裝后置于-80 ℃保存。冰上剝離大鼠腦組織,分離出海馬及皮層,分別制成10%、20%腦組織勻漿,4 ℃、3500 r/min離心10 min,取上清液分裝后置于-80 ℃保存。取血清、20%海馬及皮層,流式細(xì)胞儀檢測IL-1α、IL-2、TNF含量;ELISA檢測10%海馬及皮層IFN-γ含量,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

    3? 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,實驗數(shù)據(jù)以x(—)±s表示,采用方差分析及多組間均數(shù)兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    4? 結(jié)果

    4.1? 類葉升麻苷對模型大鼠Y迷宮實驗測試指標(biāo)的影響

    模型組大鼠新異臂進(jìn)入次數(shù)顯著低于假手術(shù)組(P<0.01),各給藥組大鼠新異臂進(jìn)入次數(shù)顯著高于模型組(P<0.05,P<0.01);新異臂停留時間占總時間百分比差異雖無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但存在趨勢,模型組相對較低;模型組大鼠新異臂潛伏期顯著高于假手術(shù)組(P<0.01),各給藥組大鼠新異臂潛伏期顯著低于模型組(P<0.01),起始臂進(jìn)入次數(shù)低于模型組;模型組大鼠其他臂進(jìn)入次數(shù)顯著高于假手術(shù)組(P<0.01),各給藥組大鼠其他臂進(jìn)入次數(shù)明顯低于模型組(P<0.05,P<0.01);起始臂及其他臂停留時間占總時間百分比各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

    4.2? 類葉升麻苷對模型大鼠跳臺實驗測試指標(biāo)的影響

    模型組大鼠潛伏期較假手術(shù)組明顯降低(P<0.01),各給藥組大鼠潛伏期顯著高于模型組(P<0.05,P<0.01),結(jié)果見圖1。模型組大鼠犯錯誤次數(shù)較假手術(shù)組明顯增加(P<0.01),各給藥組測試期大鼠犯錯誤次數(shù)較模型組明顯減少(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果見圖2。

    4.3? 類葉升麻苷對模型大鼠血清、海馬及皮層白細(xì)胞介素-1α、白細(xì)胞介素-2、腫瘤壞死因子和干擾素-γ含量的影響

    與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清、海馬和皮層IL-1α、IL-2、TNF含量明顯增加,海馬IFN-γ含量明顯減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,AS低、高劑量組大鼠血清、海馬和皮層IL-1α、IL-2、TNF含量明顯降低,海馬IFN-γ含量明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),尼莫地平組大鼠血清IL-1α、IL-2含量明顯降低,海馬和皮層IL-2、TNF含量明顯降低,海馬和皮層IFN-γ含量明顯增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果見圖3~圖6。

    5? 討論

    本實驗采取MCAO方法建立血管性癡呆大鼠模型,模擬血管性癡呆的發(fā)病過程,觀察AS對血管性癡呆的影響。Longa神經(jīng)體征評分對腦缺血造模成功的判定是一種客觀、準(zhǔn)確且簡便的方法,凡表現(xiàn)病理性神經(jīng)體征的大鼠均造模成功。Y迷宮實驗主要研究嚙齒類動物的空間識別記憶能力,該迷宮利用了嚙齒類動物對新異環(huán)境天然探究的自然習(xí)性,不需要動物學(xué)習(xí)任何規(guī)則趨利避害,能有效反映動物對新異環(huán)境的識別記憶能力。根據(jù)Y迷宮實驗結(jié)果可知,模型組大鼠對新環(huán)境的識別能力下降,而尼莫地平組和AS低、高劑量組可顯著提高該能力,增強(qiáng)大鼠對新環(huán)境的探索及記憶能力。跳臺實驗主要考察動物的被動記憶能力,模型組大鼠跳臺實驗潛伏期顯著高于假手術(shù)組且犯錯誤次數(shù)明顯增加,而尼莫地平組和AS低、高劑量組可顯著增加潛伏期并減少犯錯誤次數(shù),說明AS能夠明顯改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙。

    腦缺血再灌注損傷后大腦會產(chǎn)生一系列病理變化,包括自由基生成增多、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、Ca2+水平失衡,炎癥反應(yīng)等,其中炎癥反應(yīng)是腦缺血損傷的重要機(jī)制之一。IL-1是一種常見的致炎因子,其中IL-1α作為一種重要的促炎因子,參與機(jī)體抗微生物感染、無菌炎癥以及部分自發(fā)炎癥的調(diào)節(jié),IL-1α可促進(jìn)炎性介質(zhì)和氧自由基的釋放,作用于腦組織血管內(nèi)皮,引起腦水腫,并產(chǎn)生一系列級聯(lián)放大的炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致腦組織損傷。IL-2是一種激活T細(xì)胞并維持T細(xì)胞分化和增殖的T細(xì)胞生長因子,同時也參與炎癥或自身免疫性反應(yīng)。IL-2不僅可以刺激活化T細(xì)胞分泌淋巴因子,參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用,而且可增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的細(xì)胞毒性。研究發(fā)現(xiàn),IL-2可抑制降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的合成和釋放,而CGRP能拮抗ET從而引起腦血流量的減少[7]。甘佳樂等[8]研究發(fā)現(xiàn),MCAO大鼠模型可導(dǎo)致IL-2顯著增多,從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示,尼莫地平及AS均可顯著降低血清IL-1α、IL-2的含量,而AS還可明顯減少海馬及皮層IL-1α、IL-2的含量,說明AS較尼莫地平對腦組織中炎癥因子具有更為明顯的作用。TNF是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子,是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一,但其在高濃度時會誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致一些如膿毒性休克等病理結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn),AS可顯著降低大鼠血清、海馬和皮層TNF含量,而尼莫地平組僅可降低皮層中TNF含量,這可能與2種藥物作用機(jī)制不同有關(guān),AS改善大鼠缺血再灌注的作用可能與調(diào)節(jié)炎癥因子的作用途徑更相關(guān),而尼莫地平主要通過舒張血管、改善腦部微循環(huán)起作用[9]。IFN-γ是一種高效的抗病毒生物活性物質(zhì),并可增強(qiáng)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活力,從而起到免疫調(diào)節(jié)作用[10]。AS主要增加血清及海馬中IFN-γ含量,對皮層中IFN-γ含量影響不大,這可能與AS的作用靶點和靶點劑量敏感性不同以及腦內(nèi)血液循環(huán)等相關(guān),有待進(jìn)一步研究。

    本實驗結(jié)果表明,與模型組比較,AS可明顯改善模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙,顯著降低血清、海馬及皮層IL-1α、IL-2及TNF含量,并增加IFN-γ含量。因此,AS可能是通過抑制腦缺血后炎癥反應(yīng),對機(jī)體產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用,從而起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用,改善缺血再灌注損傷,進(jìn)而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)及改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用。

    參考文獻(xiàn):

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    [2] 高莉,彭曉明,霍仕霞,等.類葉升麻苷對缺糖缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中成藥,2015,37(8):1821-1823.

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    (收稿日期:2018-08-29)

    (修回日期:2018-09-24;編輯:華強(qiáng))

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