類葉升麻苷對腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及炎癥因子的影響

任佳 高莉 譚雪 閆明

摘要：目的? 觀察類葉升麻苷對腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶及炎癥因子的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。方法? 30只SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組和類葉升麻苷低、高劑量組，每組6只。采用線栓法制作大腦中動脈栓塞慢性缺血再灌注癡呆大鼠模型，通過跳臺、Y迷宮實驗檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，采用流式細(xì)胞儀及ELISA試劑盒測定血清、海馬及皮層中白細(xì)胞介素（IL）-1α、IL-2、腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素-γ（IFN-γ）的含量。結(jié)果? Y迷宮實驗結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠新異臂進(jìn)入次數(shù)減少，其他臂進(jìn)入次數(shù)增加，新異臂潛伏期增加（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，尼莫地平組和類葉升麻苷低、高劑量組大鼠新異臂進(jìn)入次數(shù)增加，其他臂進(jìn)入次數(shù)減少，新異臂潛伏期減少（P<0.05，P<0.01）。跳臺實驗結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠測試期潛伏期減少，犯錯誤次數(shù)增加（P<0.01）;與模型組比較，類葉升麻苷低、高劑量組大鼠測試期潛伏期增加，犯錯誤次數(shù)減少（P<0.05，P<0.01）;流式細(xì)胞儀及ELISA試劑盒檢測顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清、海馬和皮層IL-1α、IL-2、TNF含量明顯增加（P<0.05，P<0.01），海馬IFN-γ含量明顯減少（P<0.05）;與模型組比較，類葉升麻苷低、高劑量組大鼠血清、海馬和皮層IL-1α、TNF含量明顯降低，血清、海馬IL-2明顯降低（P<0.05，P<0.01），海馬IFN-γ含量明顯增加（P<0.01）。結(jié)論? 類葉升麻苷可提高M(jìn)CAO大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，且可有效降低模型大鼠炎癥因子水平，其對模型大鼠的防治作用可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：類葉升麻苷;缺血再灌注;學(xué)習(xí)記憶功能障礙;炎癥因子

中圖分類號：R285.5? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2019）04-0047-05

血管性癡呆主要是指同腦血管疾病具有關(guān)聯(lián)的癡呆，因腦血管因素而形成了認(rèn)知與智能等功能障礙。類葉升麻苷（Acteoside，AS）又名毛蕊花糖苷、麥角甾苷，是肉蓯蓉中一種水溶性較強(qiáng)的苯乙醇苷類活性成分，具有抗氧化損傷、神經(jīng)保護(hù)、改善記憶、調(diào)節(jié)免疫的作用[1-2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，AS可顯著改善雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法所致血管性癡呆引起的學(xué)習(xí)記憶功能減退和抑郁情緒障礙，并通過降低血清和腦組織丙二醛（MDA）、活性氧簇（ROS）含量及提高谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，減少氧化應(yīng)激損傷。因此，本研究采取制作大腦中動脈栓塞慢性缺血再灌注）模型[3-4]模擬血管性癡呆，從學(xué)習(xí)記憶損傷、炎癥因子表達(dá)等方面探究AS對在體動物缺血再灌注所致血管性癡呆的神經(jīng)保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。

1? 實驗材料

1.1? 動物

清潔級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量（360±20）g，購自新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心，動物許可證號SCXK（新）2011-0001。大鼠均飼養(yǎng)于石河子大學(xué)SPF級動物房，溫度20～25 ℃，12 h/12 h光照明暗交替，自由攝食飲水。

1.2? 主要藥物與試劑

AS（純度≥98%），本實驗室自制;尼莫地平片，亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號170602。

1.3? 主要試劑與儀器

大鼠白細(xì)胞介素（IL）-1α高通量液相蛋白定量試劑盒，北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司;大鼠IL-2高通量液相蛋白定量套裝，北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司;大鼠腫瘤壞死因子（TNF）高通量液相蛋白定量套裝，北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司;干擾素-γ（IFN-γ）ELISA測定試劑盒，上海江萊生物有限公司。XR-XY1032 Y迷宮視頻分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司），YLS-3TB跳臺記錄儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司），流式細(xì)胞儀、Go1510全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fisher），Allegra 64R離心機(jī)（BECKMAN），TL2010S高通量組織研磨儀（SOP-EQ036）。

2? 實驗方法

2.1? 造模

10%水合氯醛腹腔注射300 mg/kg麻醉，去除頸前鼠毛并消毒。沿頸部正中切開，在右側(cè)肩胛舌骨和胸鎖乳突肌形成的三角處，以止血鉗鈍性分離，暴露頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA）。結(jié)扎ECA分支枕動脈、甲狀腺上動脈及ECA終末支，分離ICA顱外分支翼腭動脈。將ECA結(jié)扎并剪斷，把ECA遠(yuǎn)心端拉直與ICA成直線，并在分叉處松松結(jié)扎一根4-0絲線。用動脈夾夾閉CCA、ICA，在ECA上剪一小切口。移去CCA上的動脈夾，縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠只分離CCA、ECA和ICA，不插入栓線。MCAO大鼠麻醉清醒后，參照Longa等[5]及Bederon等[6]的5分制評分方法對實驗大鼠的神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評分，2～4分者納入實驗。

2.2? 分組和給藥

造模完成后，按照大鼠體質(zhì)量及神經(jīng)行為學(xué)評分雙因素對模型大鼠進(jìn)行篩選分組，選取造模成功大鼠30只。假手術(shù)組6只，將其余造模成功24只大鼠隨機(jī)分為模型組、尼莫地平組（12.5 mg/kg）、AS低劑量組（6.25 mg/ kg）、AS高劑量組（12.5 mg/kg），每組6只。各給藥組予相應(yīng)劑量藥液灌胃，假手術(shù)組和模型組予等體積超純水灌胃。給藥體積0.1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)21 d。

2.3? 行為學(xué)測試

2.3.1? Y迷宮實驗

Y迷宮訓(xùn)練：新異臂被隔板擋住，大鼠由起始臂放入，在起始臂和其他臂中自由活動10 min，訓(xùn)練結(jié)束后，大鼠被放回飼養(yǎng)籠。Y迷宮檢測：訓(xùn)練結(jié)束后4 h進(jìn)行，抽開新異臂隔板，大鼠由起始臂放入，在3個臂中自由活動5 min。錄像記錄5 min內(nèi)每只大鼠在各個臂停留的時間和穿梭次數(shù)。統(tǒng)計并分析大鼠在各個臂停留時間占總時間百分比、進(jìn)入次數(shù)及新異臂潛伏期。

2.3.2? 跳臺實驗

在開展實驗前，將大鼠放入跳臺儀的反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3 min。跳臺訓(xùn)練：用手抓住大鼠背部放在跳臺箱的平臺上，然后立即通36 V交流電，訓(xùn)練5 min，記錄計時開始至大鼠第1次跳下平臺遭受電擊的時間（潛伏期）及大鼠下臺遭受電擊的次數(shù)（錯誤次數(shù)）作為學(xué)習(xí)成績。跳臺測試：訓(xùn)練結(jié)束后24 h測試其記憶能力，記錄潛伏期及即錯誤次數(shù)，作為記憶成績。

2.4? 指標(biāo)測定

行為學(xué)實驗結(jié)束后，腹主動脈取血，4 ℃、3000 r/min離心15 min，取血清分裝后置于-80 ℃保存。冰上剝離大鼠腦組織，分離出海馬及皮層，分別制成10%、20%腦組織勻漿，4 ℃、3500 r/min離心10 min，取上清液分裝后置于-80 ℃保存。取血清、20%海馬及皮層，流式細(xì)胞儀檢測IL-1α、IL-2、TNF含量;ELISA檢測10%海馬及皮層IFN-γ含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

3? 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，實驗數(shù)據(jù)以x（—）±s表示，采用方差分析及多組間均數(shù)兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 類葉升麻苷對模型大鼠Y迷宮實驗測試指標(biāo)的影響

模型組大鼠新異臂進(jìn)入次數(shù)顯著低于假手術(shù)組（P<0.01），各給藥組大鼠新異臂進(jìn)入次數(shù)顯著高于模型組（P<0.05，P<0.01）;新異臂停留時間占總時間百分比差異雖無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但存在趨勢，模型組相對較低;模型組大鼠新異臂潛伏期顯著高于假手術(shù)組（P<0.01），各給藥組大鼠新異臂潛伏期顯著低于模型組（P<0.01），起始臂進(jìn)入次數(shù)低于模型組;模型組大鼠其他臂進(jìn)入次數(shù)顯著高于假手術(shù)組（P<0.01），各給藥組大鼠其他臂進(jìn)入次數(shù)明顯低于模型組（P<0.05，P<0.01）;起始臂及其他臂停留時間占總時間百分比各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。

4.2? 類葉升麻苷對模型大鼠跳臺實驗測試指標(biāo)的影響

模型組大鼠潛伏期較假手術(shù)組明顯降低（P<0.01），各給藥組大鼠潛伏期顯著高于模型組（P<0.05，P<0.01），結(jié)果見圖1。模型組大鼠犯錯誤次數(shù)較假手術(shù)組明顯增加（P<0.01），各給藥組測試期大鼠犯錯誤次數(shù)較模型組明顯減少（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖2。

4.3? 類葉升麻苷對模型大鼠血清、海馬及皮層白細(xì)胞介素-1α、白細(xì)胞介素-2、腫瘤壞死因子和干擾素-γ含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清、海馬和皮層IL-1α、IL-2、TNF含量明顯增加，海馬IFN-γ含量明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，AS低、高劑量組大鼠血清、海馬和皮層IL-1α、IL-2、TNF含量明顯降低，海馬IFN-γ含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），尼莫地平組大鼠血清IL-1α、IL-2含量明顯降低，海馬和皮層IL-2、TNF含量明顯降低，海馬和皮層IFN-γ含量明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖3～圖6。

5? 討論

本實驗采取MCAO方法建立血管性癡呆大鼠模型，模擬血管性癡呆的發(fā)病過程，觀察AS對血管性癡呆的影響。Longa神經(jīng)體征評分對腦缺血造模成功的判定是一種客觀、準(zhǔn)確且簡便的方法，凡表現(xiàn)病理性神經(jīng)體征的大鼠均造模成功。Y迷宮實驗主要研究嚙齒類動物的空間識別記憶能力，該迷宮利用了嚙齒類動物對新異環(huán)境天然探究的自然習(xí)性，不需要動物學(xué)習(xí)任何規(guī)則趨利避害，能有效反映動物對新異環(huán)境的識別記憶能力。根據(jù)Y迷宮實驗結(jié)果可知，模型組大鼠對新環(huán)境的識別能力下降，而尼莫地平組和AS低、高劑量組可顯著提高該能力，增強(qiáng)大鼠對新環(huán)境的探索及記憶能力。跳臺實驗主要考察動物的被動記憶能力，模型組大鼠跳臺實驗潛伏期顯著高于假手術(shù)組且犯錯誤次數(shù)明顯增加，而尼莫地平組和AS低、高劑量組可顯著增加潛伏期并減少犯錯誤次數(shù)，說明AS能夠明顯改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙。

腦缺血再灌注損傷后大腦會產(chǎn)生一系列病理變化，包括自由基生成增多、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、Ca2+水平失衡，炎癥反應(yīng)等，其中炎癥反應(yīng)是腦缺血損傷的重要機(jī)制之一。IL-1是一種常見的致炎因子，其中IL-1α作為一種重要的促炎因子，參與機(jī)體抗微生物感染、無菌炎癥以及部分自發(fā)炎癥的調(diào)節(jié)，IL-1α可促進(jìn)炎性介質(zhì)和氧自由基的釋放，作用于腦組織血管內(nèi)皮，引起腦水腫，并產(chǎn)生一系列級聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致腦組織損傷。IL-2是一種激活T細(xì)胞并維持T細(xì)胞分化和增殖的T細(xì)胞生長因子，同時也參與炎癥或自身免疫性反應(yīng)。IL-2不僅可以刺激活化T細(xì)胞分泌淋巴因子，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用，而且可增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的細(xì)胞毒性。研究發(fā)現(xiàn)，IL-2可抑制降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的合成和釋放，而CGRP能拮抗ET從而引起腦血流量的減少[7]。甘佳樂等[8]研究發(fā)現(xiàn)，MCAO大鼠模型可導(dǎo)致IL-2顯著增多，從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示，尼莫地平及AS均可顯著降低血清IL-1α、IL-2的含量，而AS還可明顯減少海馬及皮層IL-1α、IL-2的含量，說明AS較尼莫地平對腦組織中炎癥因子具有更為明顯的作用。TNF是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一，但其在高濃度時會誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致一些如膿毒性休克等病理結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，AS可顯著降低大鼠血清、海馬和皮層TNF含量，而尼莫地平組僅可降低皮層中TNF含量，這可能與2種藥物作用機(jī)制不同有關(guān)，AS改善大鼠缺血再灌注的作用可能與調(diào)節(jié)炎癥因子的作用途徑更相關(guān)，而尼莫地平主要通過舒張血管、改善腦部微循環(huán)起作用[9]。IFN-γ是一種高效的抗病毒生物活性物質(zhì)，并可增強(qiáng)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用[10]。AS主要增加血清及海馬中IFN-γ含量，對皮層中IFN-γ含量影響不大，這可能與AS的作用靶點和靶點劑量敏感性不同以及腦內(nèi)血液循環(huán)等相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

本實驗結(jié)果表明，與模型組比較，AS可明顯改善模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，顯著降低血清、海馬及皮層IL-1α、IL-2及TNF含量，并增加IFN-γ含量。因此，AS可能是通過抑制腦缺血后炎癥反應(yīng)，對機(jī)體產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用，從而起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，改善缺血再灌注損傷，進(jìn)而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)及改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 羅嘉楠，高莉，黃晏，等.類葉升麻苷對β-淀粉樣蛋白聚集影響的體外研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017，40（2）：220-223，228.

[2] 高莉，彭曉明，霍仕霞，等.類葉升麻苷對缺糖缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中成藥，2015，37（8）：1821-1823.

[3] 尹軍祥，田金洲，黃啟福，等.MCAO擬血管性癡呆大鼠模型的建立[J].中國病理生理雜志，2003，19（8）：137-140，150.

[4] 張秀麗，孟盼，向韻，等.補(bǔ)陽還五精簡方的體外篩選及體內(nèi)驗證研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2017，24（2）：49-54.

[5] LONGA E Z，WEINSTEIN P R，ARLSON S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke， 1989，20（1）：84.

[6] BEDERSON J B，PITTS L H，TSUJI M， et al. Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke，1986，17（3）：472.

[7] 盛樹力，張萬江，伍潔，等.降鈣素基因相關(guān)肽對腦血管和腦血流量的影響[J].首都醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1990，11（14）：259-265.

[8] 甘佳樂，劉敬霞，黑長春，等.回藥扎里奴思方對大腦中動脈閉塞模型大鼠白細(xì)胞介素-6、-2含量的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2017，37（7）：1576-1579.

[9] 張枝雪，黃茜，李玥，等.尼莫地平對MCAO/R模型大鼠不同時間點血流灌注量的影響[J].中國民族民間醫(yī)藥，2017，26（7）：42-45.

[10] 方明，張國慶.清氣化痰湯加減聯(lián)合西醫(yī)治療急性期COPD療效觀察及對血清INF-γ、TGF-α的影響[J].中藥材，2018，41（4）：992-994.

（收稿日期：2018-08-29）

（修回日期：2018-09-24;編輯：華強(qiáng)）