補(bǔ)充維生素C對劇烈運(yùn)動(dòng)后人體血清炎癥因子水平的影響及ROS/NF—κB信號(hào)通路在其中的作用

劉紹東++張彥秋

摘 要：目的：探討補(bǔ)充維生素C對劇烈運(yùn)動(dòng)后人體血清炎癥因子水平的影響及ROS/NF-κB信號(hào)通路在其中的作用。方法：隨機(jī)選取20名健康男性在校大學(xué)生，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。運(yùn)動(dòng)開始前分別給予兩組大學(xué)生維生素C片3.0 g和安慰劑口服。兩組大學(xué)生分別按照75%VO2max進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，持續(xù)時(shí)間為1 h，并于運(yùn)動(dòng)干預(yù)開始前10 min、結(jié)束后0 h和2 h分別采集靜脈血，分離血清和血細(xì)胞，并利用ELISA法檢測外周血IL-1、IL-6、IL-8含量；由血細(xì)胞中分離白細(xì)胞后，分別測定白細(xì)胞中活性氧（ROS）水平和IKKα激酶活性。結(jié)果：劇烈運(yùn)動(dòng)后，兩組大學(xué)生外周血白細(xì)胞均明顯升高，組間無明顯差異；對照組外周血IL-1、IL-6、IL-8含量均表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，而實(shí)驗(yàn)組未表現(xiàn)出此趨勢，其中IL-1水平運(yùn)動(dòng)前后無明顯變化。此外，兩組大學(xué)生外周血白細(xì)胞中IKKα活性均表現(xiàn)出先升后降的變化趨勢，其中實(shí)驗(yàn)組升高趨勢明顯低于對照組。而白細(xì)胞中ROS水平卻表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，其中以對照組升高趨勢更明顯，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：劇烈運(yùn)動(dòng)可以引起白細(xì)胞中ROS/NF-κB信號(hào)通路活化和血清炎癥因子水平升高，而運(yùn)動(dòng)前補(bǔ)充維生素C可以有效抑制白細(xì)胞中ROS/NF-κB信號(hào)通路活化介導(dǎo)的血清炎癥因子水平升高。

關(guān)鍵詞：劇烈運(yùn)動(dòng)；ROS/NF-κB信號(hào)通路；炎癥因子；維生素C

中圖分類號(hào)：G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-2076（2015）03-0062-05

Abstract：Objective： To illustrate the effect of Vitamin C on the serum level of inflammatory factors and the role of ROS/NF-κB signaling pathway.Methods：10 healthy male college students were randomly selected and equally divided into experiment group and control group. Vitamin C （3.0 g） and placebo were given prior to treadmill running exercise for 1 h， the strength of which was equal to 75% VO2max. Venous blood was collected at 10 min before the beginning， 0 h and 2 h after the end of the exercise， respectively. The levels of IL-1， IL-6 and IL-8 were detected using ELISA method. The level of reactive oxygen species （ROS） and the activity of IKKα in white blood cells were also measured.Results： After the strenuous exercise， the leukocyte number in peripheral blood was significantly increased in both groups， however， there was no significant differences. The levels

近年來，運(yùn)動(dòng)與免疫的關(guān)系已成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，人體長期堅(jiān)持進(jìn)行適量的有氧運(yùn)動(dòng)可以明顯改善機(jī)體免疫機(jī)能，而長時(shí)間、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可引起人體免疫機(jī)能短期內(nèi)迅速減退、免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡，并可導(dǎo)致機(jī)體抗病能力降低[1-3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可引起大鼠骨髓中有核細(xì)胞產(chǎn)生量明顯減少以及胸腺萎縮，而胸腺萎縮可進(jìn)一步誘使T淋巴細(xì)胞增殖、分化和成熟障礙[4]。與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行短時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)后，機(jī)體外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)明顯降低，淋巴細(xì)胞中DNA氧化損傷明顯增加，外周血中IL-6水平急劇升高，且IL-1水平也有明顯升高，并持續(xù)至運(yùn)動(dòng)后24 h[5-8]。由此可見，免疫失衡和炎癥介質(zhì)的異常釋放是除激素、神經(jīng)遞質(zhì)、骨骼肌損傷和Toll樣受體表達(dá)之外，運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的重要機(jī)制，但I(xiàn)L-1和IL-6等炎癥介質(zhì)異常釋放的具體機(jī)制仍尚未闡明[9]。

維生素C是一種常見的水溶性維生素，它可以作為電子供體直接清除活性氧（reactive oxygen species，ROS），因此，維生素C常被視為細(xì)胞外液中主要的抗氧化物質(zhì)[10]。為了闡明上述問題，本實(shí)驗(yàn)擬選取在校大學(xué)生進(jìn)行大強(qiáng)度長時(shí)間體育活動(dòng)，并用維生素C預(yù)干預(yù)，觀察其外周血中ROS/核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor - κB，NF-κB）信號(hào)通路的活化情況，評估其在劇烈運(yùn)動(dòng)和補(bǔ)充維生素C對人體外周血炎癥因子釋放調(diào)節(jié)中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象和主要試劑

由某高校隨機(jī)選取20名男性在校大學(xué)生參加本次研究，平均年齡為22.7±0.95歲。所有大學(xué)生入組時(shí)均進(jìn)行全身體格檢查，心肺聽診和體表心電圖檢查，以進(jìn)一步評估其心肺功能，盡量避免實(shí)驗(yàn)過程可能出現(xiàn)的安全隱患，受試者均身體健康，無器質(zhì)性病變。

維生素C片購自湖北華中制藥有限公司；人外周血白細(xì)胞分離液試劑盒購自天津?yàn)笊镏破酚邢薰?；?xì)胞活性氧檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司；細(xì)胞IKKα激酶活性定量檢測試劑盒購自上海一基生物試劑有限公司；人IL-1、IL-6、IL-8 ELISA檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和運(yùn)動(dòng)方案

將20名大學(xué)生隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組（均為n=10），在運(yùn)動(dòng)干預(yù)開始前2 w集中進(jìn)行負(fù)荷遞增的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，利用運(yùn)動(dòng)心肺測試系統(tǒng)（Jaeger，德國）實(shí)時(shí)測定以下指標(biāo)：攝氧量（volume of oxygen uptake，VO2）、CO2呼出量（volume of expiratory CO2，VCO2）、呼吸交換率和心率。測試結(jié)束后，根據(jù)每個(gè)人的最大VO2（VO2max）分別建立VO2與跑臺(tái)速度的回歸方程，計(jì)算75%VO2max對應(yīng)的速度，并作為本次實(shí)驗(yàn)的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷。[JP]

為了避免飲食對人外周血炎癥因子含量的影響，在運(yùn)動(dòng)干預(yù)開始前2 w即對所有20名大學(xué)生進(jìn)行合理膳食教育和指導(dǎo)。督促其科學(xué)合理安排三餐，保證各類營養(yǎng)素種類齊全、比例適宜、數(shù)量充足。除正常進(jìn)餐外，不額外加餐，不吃零食，不吸煙飲酒，研究人員每日隨訪記錄其就餐情況，以保證實(shí)驗(yàn)期間飲食結(jié)構(gòu)的合理性。

1.3 分組干預(yù)

運(yùn)動(dòng)干預(yù)當(dāng)日早8時(shí)，所有20名大學(xué)生統(tǒng)一進(jìn)食早餐，實(shí)驗(yàn)組10名大學(xué)生隨餐送服維生素C片3.0 g，對照組10名大學(xué)生給予安慰劑（淀粉片）。進(jìn)食早餐后30 min開始準(zhǔn)備活動(dòng)，隨后以前期計(jì)算所得運(yùn)動(dòng)負(fù)荷進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為1 h。運(yùn)動(dòng)干預(yù)開始前10 min、結(jié)束后0 h和2 h分別采集靜脈血5 mL，其中2 mL注入抗凝管并搖晃數(shù)次用于檢測血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，剩余3 mL注入普通采血管，靜置2 h后以2 500 rpm離心5 r/min，其中上清液用于測定血清中炎癥因子含量，下層血細(xì)胞用于分離白細(xì)胞。

1.4 ELISA

按照人血清ELISA檢測試劑盒操作說明，分別檢測外周血IL-1、IL-6、IL-8含量，樣本量為n=10，各組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.5 白細(xì)胞分離

分組干預(yù)結(jié)束后，收集所有血液標(biāo)本，用于集中分離提取白細(xì)胞。按照人外周血白細(xì)胞分離液試劑盒說明書進(jìn)行具體操作，裂解紅細(xì)胞，分離提取白細(xì)胞。

1.6 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測定

為測定白細(xì)胞內(nèi)ROS水平，將新鮮分離所得白細(xì)胞用37℃預(yù)熱的PBS（含10 μmol/L H2DCFDA，ROS熒光探針）重懸，37℃孵育30 min，隨后800 rpm離心5 min，棄上清，用PBS洗滌2次后用500 μL重懸，立即于流式細(xì)胞儀測定488 nm激發(fā)波長處綠色熒光強(qiáng)度，樣本量為n=10。

1.7 白細(xì)胞IKKα激酶活性

按照細(xì)胞IKKα激酶活性定量檢測試劑盒說明書中的操作步驟分別測定各組白細(xì)胞IKKα激酶活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS 17.0上進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)

如圖1所示，劇烈運(yùn)動(dòng)后，實(shí)驗(yàn)組和對照組人外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯升高（均為P<0.01），且兩組間白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高幅度無明顯差異（P>0.05）。與運(yùn)動(dòng)

3 討論

本研究利用在校男大學(xué)生進(jìn)行1小時(shí)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，于運(yùn)動(dòng)前后采集外周血，檢測血清中炎癥因子表達(dá)水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞中ROS水平和IKKα活性，以闡述ROS/NF-κB信號(hào)通路在劇烈運(yùn)動(dòng)誘發(fā)炎癥因子釋放中的作用，同時(shí)設(shè)立維生素C干預(yù)組，評估運(yùn)動(dòng)前補(bǔ)充維生素C對上述過程的影響及其中可能的機(jī)制。研究結(jié)果證實(shí)：劇烈運(yùn)動(dòng)可能通過誘導(dǎo)外周血白細(xì)胞中ROS/NF-κB信號(hào)通路的活化進(jìn)而促進(jìn)IL-1、IL-6和IL-8等炎癥介質(zhì)的合成和釋放，而維生素C可顯著降低白細(xì)胞中ROS水平，抑制NF-κB的活化，從而發(fā)揮減輕劇烈運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)釋放的保護(hù)作用。

長時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，糖皮質(zhì)激素和腎上腺素等應(yīng)激激素將隨之升高，上述激素（尤其是糖皮質(zhì)激素）可促進(jìn)儲(chǔ)存池中白細(xì)胞釋放進(jìn)入循環(huán)池[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在校大學(xué)生以相當(dāng)于75%VO2max的高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)1 h可引起外周血中白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高，而且這一作用至少持續(xù)2 h以上，同時(shí)，血清中IL-1、IL-6、IL-8三種主要炎癥因子的含量也表現(xiàn)出明顯的升高趨勢。其中，單核-巨噬細(xì)胞含量升高可能是IL-1和IL-6水平升高的主要原因，而IL-6水平的過度升高則可誘發(fā)機(jī)體抵抗細(xì)菌感染的能力明顯降低[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在劇烈運(yùn)動(dòng)誘發(fā)機(jī)體高表達(dá)炎癥因子的同時(shí)，白細(xì)胞中ROS和IKKα活性均表現(xiàn)出明顯升高的趨勢，而ROS/NF-κB信號(hào)通路已被證實(shí)參與多種細(xì)胞表達(dá)炎癥因子的過程[15-16]，因此，通過本研究結(jié)果可以初步得出ROS/NF-κB信號(hào)通路參與劇烈運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)機(jī)體外周血炎癥因子水平升高的結(jié)論。

維生素C是一種常見的抗氧化物質(zhì)，具有容易獲取、價(jià)格低和抗氧化作用明顯等特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)前給予維生素C口服可以有效抑制劇烈運(yùn)動(dòng)上調(diào)白細(xì)胞中ROS水平的幅度明顯下降，即有效抑制劇烈運(yùn)動(dòng)引起的氧化爆發(fā)。IKKα是NF-κB活化的重要標(biāo)志，本研究還發(fā)現(xiàn)，在口服維生素C抑制白細(xì)胞氧化爆發(fā)的同時(shí)，白細(xì)胞中IKKα活化程度也明顯較對照組明顯降低，這說明維生素C可能通過抑制ROS產(chǎn)生而下調(diào)IKKα活性，從而抑制IκB磷酸化程度，減少NF-κB向細(xì)胞核移位，抑制炎癥因子相關(guān)基因的表達(dá)活性。

綜上所述，劇烈運(yùn)動(dòng)前補(bǔ)充維生素C可能通過抑制白細(xì)胞中ROS/NF-κB信號(hào)通路的活化下調(diào)炎癥因子表達(dá)，繼而減輕劇烈運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的免疫功能紊亂，而進(jìn)一步研究將有助于明確維生素C在預(yù)防劇烈運(yùn)動(dòng)誘發(fā)免疫功能紊亂中作用，為降低運(yùn)動(dòng)員比賽和訓(xùn)練后上呼吸道感染等事件發(fā)生率提供有效的防治策略。

參考文獻(xiàn)：[HT5"SS]

[1]Tofighee A， Khazaei HA， Jalili A. Comparison of Effect of One Course of Intense Exercise （Wingate test） on Serum Levels of Interleukin-17 in Different Groups of Athletes [J]. Asian J Sports Med， 2014 ， 5（4）：e22769.

[2]Cruzat VF， Krause M， Newsholme P. Amino acid supplementation and impact on immune function in the context of exercise [J]. J Int Soc Sports Nutr， 2014， 11（1）：61.

[3]Jahromi AS， Zar A， Ahmadi F，et al.Effects of Endurance Training on the Serum Levels of Tumour Necrosis Factor-α and Interferon-γ in Sedentary Men [J]. Immune Netw， 2014， 14（5）：255-259.

[4]Kakanis MW， Peake J， Brenu EW，et al. The open window of susceptibility to infection after acute exercise in healthy young male elite atllletes [J]. Exerc Immunol Rev， 2010， 16： 119-137.

[5]Akil M， Gurbuz U， Bicer M，et al.Selenium prevents lipid peroxidation in liver and lung tissues of rats in acute swimming exercise [J]. Bratisl Lek Listy， 2015， 116（4）：233-235.

[6]Tanimura Y， Shimizu K，Tanabe K. Effects of three consecutive days exercise on lymphocyte DNA damage in young men [J]. Eur J Appl Physiol， 2010， 110（2）： 307-314.

[7]Ives SJ， Blegen M， Coughlin MA，et al.Salivary estradiol， intereukin-6 production，and the relationship to substrate metabolism[LL][HJ2mm]

during exercise in females [J]. Eur J Appl Physiol， 2011， 111（8）： 1649-1658.

[8]Kim JS， Lee YH， Kim JC，et al.Effect of exercise training of different intensities on anti-inflammatory reaction in streptozotocin-induced diabeticrats [J]. Biol Sport， 2014 ， 31（1）：73-79.

[9]Krüger K， Agnischock S， Lechterman N，et al.Intensive resistance exercise induces lymphocyte apoptosis via cortisol and glucocorticoid receptor-dependent pathways [J]. J Appl Physiol， 2011， 110（5）： 1226-1232.

[10]王雪芹， 郝選明. 運(yùn)動(dòng)與免疫研究進(jìn)展 [J]. 中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志， 2012， 31（12）： 1127-1133.

[11]陳偉， 林映才， 馬現(xiàn)永， 等. 一些抗氧化劑的抗/促氧化作用及其機(jī)制 [J]. 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2012， 24（4）： 595-605.

[12]Zhang H， Wang ZW， Wu HB，et al.Transforming growth factor-beta 1 induces matrix metalloproteinase-9 expression in rat vascular smooth muscle cells via ROS-dependent ERK-NF-kappa B pathways [J]. Mol Cell Biochem， 2013， 375（1-2）： 11-21.

[13]Yang CT， Ling HZ， Zhang MF，et al.Oxidative stress mediates chemical hypoxia-induced injury and inflammation by activating NF-kappa b-COX-2 pathway in HaCaT cells [J]. Mol Cells， 2011， 31（6）： 531-538.

[14][JP3]Lau KK， Obeid J， Breithaupt P，et al.Effects of acute exercise on markers of inflammation in pediatric chronic kidney disease： a pilot study [J]. Pediatr Nephrol， 2015 ， 30（4）：615-621. [JP]

[15]Aoi W， Naito Y， Yoshikawa T. Role of oxidative stress in impaired insulin signaling associated with exercise-induced muscle damage [J]. Free Radic Biol Med， 2013， 65：1265-1272.

[16]El Assar M， Angulo J， Rodríguez L. Oxidative stress and vascular inflammation in aging [J]. Free Radic Biol Med， 2013， 65：380-401