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    補(bǔ)充維生素C對劇烈運(yùn)動(dòng)后人體血清炎癥因子水平的影響及ROS/NF—κB信號(hào)通路在其中的作用

    2015-08-14 20:33:03劉紹東張彥秋
    關(guān)鍵詞:維生素C劇烈運(yùn)動(dòng)炎癥因子

    劉紹東++張彥秋

    摘 要:目的:探討補(bǔ)充維生素C對劇烈運(yùn)動(dòng)后人體血清炎癥因子水平的影響及ROS/NF-κB信號(hào)通路在其中的作用。方法:隨機(jī)選取20名健康男性在校大學(xué)生,分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。運(yùn)動(dòng)開始前分別給予兩組大學(xué)生維生素C片3.0 g和安慰劑口服。兩組大學(xué)生分別按照75%VO2max進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng),持續(xù)時(shí)間為1 h,并于運(yùn)動(dòng)干預(yù)開始前10 min、結(jié)束后0 h和2 h分別采集靜脈血,分離血清和血細(xì)胞,并利用ELISA法檢測外周血IL-1、IL-6、IL-8含量;由血細(xì)胞中分離白細(xì)胞后,分別測定白細(xì)胞中活性氧(ROS)水平和IKKα激酶活性。結(jié)果:劇烈運(yùn)動(dòng)后,兩組大學(xué)生外周血白細(xì)胞均明顯升高,組間無明顯差異;對照組外周血IL-1、IL-6、IL-8含量均表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢,而實(shí)驗(yàn)組未表現(xiàn)出此趨勢,其中IL-1水平運(yùn)動(dòng)前后無明顯變化。此外,兩組大學(xué)生外周血白細(xì)胞中IKKα活性均表現(xiàn)出先升后降的變化趨勢,其中實(shí)驗(yàn)組升高趨勢明顯低于對照組。而白細(xì)胞中ROS水平卻表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢,其中以對照組升高趨勢更明顯,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:劇烈運(yùn)動(dòng)可以引起白細(xì)胞中ROS/NF-κB信號(hào)通路活化和血清炎癥因子水平升高,而運(yùn)動(dòng)前補(bǔ)充維生素C可以有效抑制白細(xì)胞中ROS/NF-κB信號(hào)通路活化介導(dǎo)的血清炎癥因子水平升高。

    關(guān)鍵詞:劇烈運(yùn)動(dòng);ROS/NF-κB信號(hào)通路;炎癥因子;維生素C

    中圖分類號(hào):G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1006-2076(2015)03-0062-05

    Abstract:Objective: To illustrate the effect of Vitamin C on the serum level of inflammatory factors and the role of ROS/NF-κB signaling pathway.Methods:10 healthy male college students were randomly selected and equally divided into experiment group and control group. Vitamin C (3.0 g) and placebo were given prior to treadmill running exercise for 1 h, the strength of which was equal to 75% VO2max. Venous blood was collected at 10 min before the beginning, 0 h and 2 h after the end of the exercise, respectively. The levels of IL-1, IL-6 and IL-8 were detected using ELISA method. The level of reactive oxygen species (ROS) and the activity of IKKα in white blood cells were also measured.Results: After the strenuous exercise, the leukocyte number in peripheral blood was significantly increased in both groups, however, there was no significant differences. The levels

    近年來,運(yùn)動(dòng)與免疫的關(guān)系已成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,人體長期堅(jiān)持進(jìn)行適量的有氧運(yùn)動(dòng)可以明顯改善機(jī)體免疫機(jī)能,而長時(shí)間、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可引起人體免疫機(jī)能短期內(nèi)迅速減退、免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡,并可導(dǎo)致機(jī)體抗病能力降低[1-3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),長時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可引起大鼠骨髓中有核細(xì)胞產(chǎn)生量明顯減少以及胸腺萎縮,而胸腺萎縮可進(jìn)一步誘使T淋巴細(xì)胞增殖、分化和成熟障礙[4]。與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行短時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)后,機(jī)體外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)明顯降低,淋巴細(xì)胞中DNA氧化損傷明顯增加,外周血中IL-6水平急劇升高,且IL-1水平也有明顯升高,并持續(xù)至運(yùn)動(dòng)后24 h[5-8]。由此可見,免疫失衡和炎癥介質(zhì)的異常釋放是除激素、神經(jīng)遞質(zhì)、骨骼肌損傷和Toll樣受體表達(dá)之外,運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的重要機(jī)制,但I(xiàn)L-1和IL-6等炎癥介質(zhì)異常釋放的具體機(jī)制仍尚未闡明[9]。

    維生素C是一種常見的水溶性維生素,它可以作為電子供體直接清除活性氧(reactive oxygen species,ROS),因此,維生素C常被視為細(xì)胞外液中主要的抗氧化物質(zhì)[10]。為了闡明上述問題,本實(shí)驗(yàn)擬選取在校大學(xué)生進(jìn)行大強(qiáng)度長時(shí)間體育活動(dòng),并用維生素C預(yù)干預(yù),觀察其外周血中ROS/核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor - κB,NF-κB)信號(hào)通路的活化情況,評估其在劇烈運(yùn)動(dòng)和補(bǔ)充維生素C對人體外周血炎癥因子釋放調(diào)節(jié)中的作用。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)對象和主要試劑

    由某高校隨機(jī)選取20名男性在校大學(xué)生參加本次研究,平均年齡為22.7±0.95歲。所有大學(xué)生入組時(shí)均進(jìn)行全身體格檢查,心肺聽診和體表心電圖檢查,以進(jìn)一步評估其心肺功能,盡量避免實(shí)驗(yàn)過程可能出現(xiàn)的安全隱患,受試者均身體健康,無器質(zhì)性病變。

    維生素C片購自湖北華中制藥有限公司;人外周血白細(xì)胞分離液試劑盒購自天津?yàn)笊镏破酚邢薰?;?xì)胞活性氧檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司;細(xì)胞IKKα激酶活性定量檢測試劑盒購自上海一基生物試劑有限公司;人IL-1、IL-6、IL-8 ELISA檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司;其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 實(shí)驗(yàn)分組和運(yùn)動(dòng)方案

    將20名大學(xué)生隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組(均為n=10),在運(yùn)動(dòng)干預(yù)開始前2 w集中進(jìn)行負(fù)荷遞增的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng),利用運(yùn)動(dòng)心肺測試系統(tǒng)(Jaeger,德國)實(shí)時(shí)測定以下指標(biāo):攝氧量(volume of oxygen uptake,VO2)、CO2呼出量(volume of expiratory CO2,VCO2)、呼吸交換率和心率。測試結(jié)束后,根據(jù)每個(gè)人的最大VO2(VO2max)分別建立VO2與跑臺(tái)速度的回歸方程,計(jì)算75%VO2max對應(yīng)的速度,并作為本次實(shí)驗(yàn)的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷。[JP]

    為了避免飲食對人外周血炎癥因子含量的影響,在運(yùn)動(dòng)干預(yù)開始前2 w即對所有20名大學(xué)生進(jìn)行合理膳食教育和指導(dǎo)。督促其科學(xué)合理安排三餐,保證各類營養(yǎng)素種類齊全、比例適宜、數(shù)量充足。除正常進(jìn)餐外,不額外加餐,不吃零食,不吸煙飲酒,研究人員每日隨訪記錄其就餐情況,以保證實(shí)驗(yàn)期間飲食結(jié)構(gòu)的合理性。

    1.3 分組干預(yù)

    運(yùn)動(dòng)干預(yù)當(dāng)日早8時(shí),所有20名大學(xué)生統(tǒng)一進(jìn)食早餐,實(shí)驗(yàn)組10名大學(xué)生隨餐送服維生素C片3.0 g,對照組10名大學(xué)生給予安慰劑(淀粉片)。進(jìn)食早餐后30 min開始準(zhǔn)備活動(dòng),隨后以前期計(jì)算所得運(yùn)動(dòng)負(fù)荷進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng),運(yùn)動(dòng)時(shí)間為1 h。運(yùn)動(dòng)干預(yù)開始前10 min、結(jié)束后0 h和2 h分別采集靜脈血5 mL,其中2 mL注入抗凝管并搖晃數(shù)次用于檢測血細(xì)胞分類計(jì)數(shù),剩余3 mL注入普通采血管,靜置2 h后以2 500 rpm離心5 r/min,其中上清液用于測定血清中炎癥因子含量,下層血細(xì)胞用于分離白細(xì)胞。

    1.4 ELISA

    按照人血清ELISA檢測試劑盒操作說明,分別檢測外周血IL-1、IL-6、IL-8含量,樣本量為n=10,各組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

    1.5 白細(xì)胞分離

    分組干預(yù)結(jié)束后,收集所有血液標(biāo)本,用于集中分離提取白細(xì)胞。按照人外周血白細(xì)胞分離液試劑盒說明書進(jìn)行具體操作,裂解紅細(xì)胞,分離提取白細(xì)胞。

    1.6 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測定

    為測定白細(xì)胞內(nèi)ROS水平,將新鮮分離所得白細(xì)胞用37℃預(yù)熱的PBS(含10 μmol/L H2DCFDA,ROS熒光探針)重懸,37℃孵育30 min,隨后800 rpm離心5 min,棄上清,用PBS洗滌2次后用500 μL重懸,立即于流式細(xì)胞儀測定488 nm激發(fā)波長處綠色熒光強(qiáng)度,樣本量為n=10。

    1.7 白細(xì)胞IKKα激酶活性

    按照細(xì)胞IKKα激酶活性定量檢測試劑盒說明書中的操作步驟分別測定各組白細(xì)胞IKKα激酶活性。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    所有計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,所有統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS 17.0上進(jìn)行。

    2 結(jié)果

    2.1 外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)

    如圖1所示,劇烈運(yùn)動(dòng)后,實(shí)驗(yàn)組和對照組人外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯升高(均為P<0.01),且兩組間白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高幅度無明顯差異(P>0.05)。與運(yùn)動(dòng)

    3 討論

    本研究利用在校男大學(xué)生進(jìn)行1小時(shí)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng),于運(yùn)動(dòng)前后采集外周血,檢測血清中炎癥因子表達(dá)水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞中ROS水平和IKKα活性,以闡述ROS/NF-κB信號(hào)通路在劇烈運(yùn)動(dòng)誘發(fā)炎癥因子釋放中的作用,同時(shí)設(shè)立維生素C干預(yù)組,評估運(yùn)動(dòng)前補(bǔ)充維生素C對上述過程的影響及其中可能的機(jī)制。研究結(jié)果證實(shí):劇烈運(yùn)動(dòng)可能通過誘導(dǎo)外周血白細(xì)胞中ROS/NF-κB信號(hào)通路的活化進(jìn)而促進(jìn)IL-1、IL-6和IL-8等炎癥介質(zhì)的合成和釋放,而維生素C可顯著降低白細(xì)胞中ROS水平,抑制NF-κB的活化,從而發(fā)揮減輕劇烈運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)釋放的保護(hù)作用。

    長時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí),機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài),糖皮質(zhì)激素和腎上腺素等應(yīng)激激素將隨之升高,上述激素(尤其是糖皮質(zhì)激素)可促進(jìn)儲(chǔ)存池中白細(xì)胞釋放進(jìn)入循環(huán)池[13]。本研究發(fā)現(xiàn),在校大學(xué)生以相當(dāng)于75%VO2max的高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)1 h可引起外周血中白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高,而且這一作用至少持續(xù)2 h以上,同時(shí),血清中IL-1、IL-6、IL-8三種主要炎癥因子的含量也表現(xiàn)出明顯的升高趨勢。其中,單核-巨噬細(xì)胞含量升高可能是IL-1和IL-6水平升高的主要原因,而IL-6水平的過度升高則可誘發(fā)機(jī)體抵抗細(xì)菌感染的能力明顯降低[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在劇烈運(yùn)動(dòng)誘發(fā)機(jī)體高表達(dá)炎癥因子的同時(shí),白細(xì)胞中ROS和IKKα活性均表現(xiàn)出明顯升高的趨勢,而ROS/NF-κB信號(hào)通路已被證實(shí)參與多種細(xì)胞表達(dá)炎癥因子的過程[15-16],因此,通過本研究結(jié)果可以初步得出ROS/NF-κB信號(hào)通路參與劇烈運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)機(jī)體外周血炎癥因子水平升高的結(jié)論。

    維生素C是一種常見的抗氧化物質(zhì),具有容易獲取、價(jià)格低和抗氧化作用明顯等特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)前給予維生素C口服可以有效抑制劇烈運(yùn)動(dòng)上調(diào)白細(xì)胞中ROS水平的幅度明顯下降,即有效抑制劇烈運(yùn)動(dòng)引起的氧化爆發(fā)。IKKα是NF-κB活化的重要標(biāo)志,本研究還發(fā)現(xiàn),在口服維生素C抑制白細(xì)胞氧化爆發(fā)的同時(shí),白細(xì)胞中IKKα活化程度也明顯較對照組明顯降低,這說明維生素C可能通過抑制ROS產(chǎn)生而下調(diào)IKKα活性,從而抑制IκB磷酸化程度,減少NF-κB向細(xì)胞核移位,抑制炎癥因子相關(guān)基因的表達(dá)活性。

    綜上所述,劇烈運(yùn)動(dòng)前補(bǔ)充維生素C可能通過抑制白細(xì)胞中ROS/NF-κB信號(hào)通路的活化下調(diào)炎癥因子表達(dá),繼而減輕劇烈運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的免疫功能紊亂,而進(jìn)一步研究將有助于明確維生素C在預(yù)防劇烈運(yùn)動(dòng)誘發(fā)免疫功能紊亂中作用,為降低運(yùn)動(dòng)員比賽和訓(xùn)練后上呼吸道感染等事件發(fā)生率提供有效的防治策略。

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