IL-4和IL-10基因多態(tài)性與腎移植受者環(huán)孢素致肝損傷的相關性研究*

艾陽文,劉 飛,李維亮,陳曉華,熊 磊,余愛榮,辛華雯△

(1.南方醫(yī)科大學藥學院，廣州 510515；2.中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床藥理科，武漢 430070)

環(huán)孢素(cyclosporine，CsA)是腎移植術中常用的免疫抑制劑，由于具有治療指數(shù)窄、個體間生物利用度差異較大的特點，不良反應時有發(fā)生，CsA在臨床廣泛應用的同時，其所致的不良反應，尤其是肝功能異常損傷也引起了關注[1]。近年來，隨著藥物蛋白組學研究和藥物基因組學研究的深入，認為年齡、性別、藥物相互作用等許多非遺傳因素會造成藥動學的差異，但20%～95%藥物反應的個體差異卻是由遺傳因素引起[2]。白細胞介素(IL)-4和IL-10均為體內(nèi)的多效抗炎細胞因子，參與調(diào)節(jié)機體的免疫反應和炎性反應[3]。IL-10可以通過抑制T淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、肥大細胞等細胞介導的免疫應答，抑制促炎細胞因子mRNA的表達，從而抑制促炎因子的合成和釋放，維持體內(nèi)免疫反應與炎性反應平衡。已有研究報道IL-4和IL-10與多種肝臟疾病，如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝炎等免疫性肝損傷及部分藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)相關，但IL-4和IL-10基因多態(tài)性是否與腎移植受者CsA所致肝損傷相關目前國內(nèi)外尚未見報道。因此，本研究選取了IL-4基因的rs2070874、rs2243250，以及IL-10基因的rs1800871、rs1800872、rs1800896位點作為研究對象，旨在探究上述基因多態(tài)性與腎移植術后CsA所致肝毒性的相關性，為尋求腎移植術后肝損傷的易感基因及術后合理用藥提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取在中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院進行同種異體腎移植術3年以上并服用CsA的患者。年齡、性別不限，無嚴重心臟疾病，隨訪資料齊全。入選患者均使用CsA+嗎替麥考酚酯(MMF)+潑尼松的三聯(lián)免疫治療方案。本研究經(jīng)中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會審核通過，所有受試對象均了解本研究的目的及實施方案且均簽署知情同意書。排除標準：排除術后失訪、術后第1周死亡、術后第1個月移植腎失功、使用他克莫司或使用西羅莫司的患者，排除有其他致肝功能異常的因素(如病毒或細菌感染、膽道疾患、其他藥物所致肝功能異常等)、移植術后3年內(nèi)肝功能資料不全的患者。共有188例患者入組，男126例、女62例。將患者分為CsA所致肝損傷組(16例)和肝功能正常的對照組(172例)。分組標準：對照組術前丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TB)、直接膽紅素(DB)正常，術后服用CsA等免疫抑制劑后，隨訪期間AST、ALT小于40 U/L，且TB<20 μmol/L、DB<5 μmol/L。CsA所致肝損傷組：(1)術前ALT、AST、TB、DB均正常，術后服用CsA后，ALT、AST峰值大于或等于3 ULN(臨床正常上限)或TB、DB大于3 ULN；(2)減少CsA給藥劑量或撤藥后肝損傷減輕或恢復正常；(3)排除其他致肝功能異常的因素(如病毒或細菌感染、膽道疾患、其他藥物所致肝功能異常等)。兩組在性別組成、移植時年齡、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)，以及移植術后7 d、1個月、3個月、6個月、1年、2年、3年的CsA口服日劑量上比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1觀察指標 統(tǒng)計所有受試對象的性別、移植時年齡、身高、體質(zhì)量、BMI、腎源(尸腎或親屬移植)、原發(fā)腎疾病、移植時間、吸煙史、乙型肝炎和丙型肝炎感染史、結(jié)核病史、高血壓病史、糖尿病史、有無急性排異等一般臨床資料，以及移植術后7 d、1個月、3個月、6個月、1年、2年、3年的CsA口服日劑量及血藥濃度、肝腎功能、空腹血糖(FPG)、血脂、血常規(guī)、血壓等實驗室檢測結(jié)果。

1.2.2CsA血藥濃度檢測 采用熒光偏振免疫法在TDx(美國Abbott Laboratories公司)分析儀上檢測全血中CsA水平。所有檢測試劑、標準品和質(zhì)控均購自美國雅培公司。CsA在150～800 μg/L范圍內(nèi)日內(nèi)和日間變異小于4%，最低檢測限25 μg /L。

1.2.3基因型檢測 采集腎移植受者血樣1 mL，采用Maxwell?RSC Whole Blood DNA Kit (美國Promega公司)提取血液中基因組DNA，并利用紫外分光光度計進行質(zhì)量控制。IL-4、IL-10各單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點信息，見表1。rs2070874，rs2243250，rs1800871，rs1800872，rs1800896位點引物設計見表2。

1.2.4PCR片段測序 采用多重 PCR技術結(jié)合高通量二代測序技術對IL-4、IL-10的各SNP位點進行測序。在單管內(nèi)進行多重 PCR擴增，純化后的PCR產(chǎn)物于Ion torrent PGM測序儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)上測序。

表1 IL-4、IL-10各SNP位點信息

1.2.5PCR片段測序 采用多重 PCR技術結(jié)合高通量二代測序技術對IL-4、IL-10的各SNP位點進行測序。在單管內(nèi)進行多重 PCR擴增，純化后的PCR產(chǎn)物于Ion torrent PGM測序儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)上測序。

表2 引物序列

F:正向引物;R:反向引物

2 結(jié) 果

2.1一般臨床資料比較 188例腎移植者中CsA致肝損傷患者16例，肝損傷發(fā)生率為8.5%，其中男性患者發(fā)生率為9.5%(12/126)，女性患者發(fā)生率為6.4%(4/62)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.504，P=0.478)。

2.2IL-4和IL-10基因各SNP位點的等位基因分布 IL-4、IL-10各SNP位點的等位基因分布頻率見表3。IL-4 rs2070874位點C等位基因在腎移植受者中突變率為22.3%(83/372)，肝損傷組為12.5%(4/32)，對照組為23.2%(79/340)。IL-4 rs2243250位點C等位基因在腎移植受者中突變率為18.5%(69/372)，肝損傷組為9.4%(3/32)，對照組為19.4%(66/340)。IL-10 rs1800871位點C等位基因在腎移植受者中突變率為28.0%(104/372)，肝損傷組為25.0%(8/32)，對照組為28.2%(96/340)。IL-10 rs1800872位點C等位基因在腎移植受者中突變率為27.1%(102/376)，肝損傷組為21.9%(7/32)，對照組為27.6%(95/344)。IL-10 rs1800896位點G等位基因在腎移植受者中突變率為6.6%(24/364)，肝損傷組為3.1%(1/32)，對照組為6.9%(23/332)。以上各SNP位點等位基因在肝損傷組與對照組間分布頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 IL-4和IL-10基因各SNP位點的等位基因分布[n(%)]

2.3IL-4和IL-10基因各SNP位點的基因型分布 IL-4、IL-10各SNP位點基因型頻率在CsA致肝損傷組和對照組中符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。經(jīng)χ2檢驗，IL-4 rs2070874、rs2243250位點及IL-10 rs1800871、rs1800872、rs1800896位點各基因型在兩組間分布頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；IL-4和IL-10各SNP位點的顯性、隱性、相加模型在兩組間分布頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

2.4單倍型分析 運用SHEsis在線分析軟件(http://analysis.bio-x.cn)對IL-4和IL-10的SNP位點進行連鎖不平衡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-4基因的rs2070874與rs2243250位點存在強連鎖不平衡(D′=0.981，r=0.763)；IL-10基因的rs1800871、rs1800872、rs1800896位點間存在完全連鎖不平衡(D′=1.000，r>0.184)。進一步對IL-4、IL-10的SNP位點進行單倍型分析，結(jié)果顯示，IL-10的C-A-A單倍型在兩組間的分布比較，差異有統(tǒng)計學意義(OR=10.68，P=0.013)，使CsA致肝損傷發(fā)生風險提高10.68倍，而IL-10其余單倍型及IL-4各單倍型與CsA所致肝損傷無明顯相關性(P<0.05)。IL-4、IL-10的單倍型在CsA致肝損傷組和對照組間分布，見表5。

表4 IL-4和IL-10基因各SNP位點的基因型分布[n(%)]

Dom：顯性模型;Rec：隱性模型；Add：相加模型；-：無數(shù)據(jù)

表5 兩組IL-4、IL-10的單倍型分布比較[n(%)]

2.5IL-4、IL-10基因多態(tài)性對CsA血藥濃度的影響 IL-4、IL-10各位點基因多態(tài)性對CsA血藥濃度的影響見表6。結(jié)果顯示：術后1個月，IL-4 rs2070874、rs2243250位點相加模型和隱性模型的CsA血藥濃度比較，差異有統(tǒng)計學意義(PAdd=0.002 3，PRec=0.003 2；PAdd=0.020 7，PRec=0.037 6)；術后3個月，IL-10 rs1800872位點顯性模型的CsA血藥濃度有顯著性差異(PDom=0.047 9)；而在移植術后其余時間點，IL-4、IL-10基因多態(tài)性對CsA血藥濃度無明顯影響(P>0.05)。

表6 IL-4、IL-10基因多態(tài)性對CsA血藥濃度的影響

續(xù)表6 IL-4、IL-10基因多態(tài)性對CsA血藥濃度的影響

PAdd：相應基因型在相加模型中兩組血藥濃度比較；PDom：相應基因型在顯性模型中兩組血藥濃度比較；Prec：相應基因型在隱性模型中兩組血藥濃度比較；NA：未分析

3 討 論

DILI包括藥物及其代謝產(chǎn)物引起直接的細胞應激(內(nèi)源性途徑)及觸發(fā)免疫反應介導的肝損傷(外源性途徑)[4]。其中促炎因子與抗炎因子之間的平衡決定了肝損傷的易感性及嚴重程度。

IL-4、IL-10是介導免疫性肝損傷的重要細胞因子，在慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎等的發(fā)生、發(fā)展中起關鍵作用。IL-4和IL-10與DILI相關。王蘭等[5]對3種肝損傷患者IL-10的表達水平研究發(fā)現(xiàn)，IL-10的表達在慢性乙型肝炎組、自身免疫性肝炎組、藥物性肝炎組均有降低，提示IL-10在以上肝損傷模型中可能存在相似的作用機制，即抑制免疫細胞對肝細胞的破壞作用。動物實驗研究表明，IL-10具有抗炎和抑制免疫反應的功能，從而發(fā)揮肝臟保護作用。趙亞樸等[6]研究發(fā)現(xiàn)，IL-10+CD8+T對Con A誘導的小鼠急性肝損傷有保護作用。程劍等[7]構(gòu)建攜帶人IL-10基因的腺病毒載體Ad5-hIL-10，發(fā)現(xiàn)采用Ad5-hIL-10進行預防性干預可以有效預防四氯化碳(CCl4)誘導的肝細胞損傷，提高肝細胞在損傷誘導劑存在情況下的存活率。IL-10預防肝損傷主要是通過抑制T淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞等細胞介導的免疫應答，抑制炎性因子mRNA的表達，從而下調(diào)炎性因子的合成和釋放[8]。因此，IL-10可以減輕肝臟炎性反應，并降低各種肝損傷物質(zhì)對肝細胞的毒性。IL-4在DILI中具有雙重作用，抑制對CYP2E1自身抗原的調(diào)節(jié)應答發(fā)揮抗炎作用，同時誘導對藥物半抗原的促炎反應[9]。動物模型中發(fā)現(xiàn)，IL-4介導雙氯西林[10]、麻醉劑氟烷[11]、甲巰咪唑(MTZ)[12]誘導的小鼠肝損傷，并且在麻醉劑DILI中具有雙重作用[13]。JARUGA等[14]研究表明，IL-4/STAT6通過增強肝細胞和竇內(nèi)皮細胞中嗜酸細胞活化趨化因子的表達，并誘導IL-5表達，在Con A誘導的肝炎中起關鍵作用，從而促進嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞向肝臟轉(zhuǎn)移并導致肝炎。

IL-10基因位于第1號染色體，包括5個外顯子和4個內(nèi)含子。對IL-10多態(tài)性的研究主要集中在啟動子區(qū)的IL-10-1082(G/A)、IL-10-819(C/T)、IL-10-592(C/A)，其他大部分主要位于非編碼區(qū)的內(nèi)含子，IL-4基因位于第5號染色體上。LIANG等[15]研究表明，IL-10-592 A/C AA基因型和IL-10-819 T/C TT基因型的遺傳多態(tài)性會增加乳腺癌患者多西他賽誘導的肝損傷的發(fā)生率。WANG等[16]研究表明，IL-4和IL-10基因多態(tài)性與抗結(jié)核藥物所致的肝毒性有明顯相關性。IL-4、IL-10的多態(tài)性可能導致其mRNA表達水平不同，從而產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)效應。

本課題組的系列研究是篩選CsA致肝損傷的易感基因，課題組前期已完成了針對339 例服用CsA的腎移植受者CYP3A4、CYP3A5、ABCB1、ABCC2、HLA-B多態(tài)性與CsA藥物肝損傷的關聯(lián)性的研究，從藥物代謝、轉(zhuǎn)運及免疫調(diào)控等方面探究CsA致肝損傷的發(fā)病機制。前期研究表明，ABCC2 rs717620的AA基因型是腎移植術后CsA肝功能異常發(fā)生的保護性因素；ABCC2 rs717620的GG基因型、CYP3A5*3、CYP3A4*18B的*1/*1基因型、ABCC2的GG/GG和ABCC2的GG/GA單倍體基因型是腎移植術后發(fā)生CsA肝功能異常的危險基因因素；而HLA-B* 1502 、ABCB1 1236C>T、ABCB1 2677G>T/A和ABCB1 3435C>T多態(tài)性與CsA所致的肝損傷無明顯相關性[17-19]。細胞因子在DILI的產(chǎn)生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，且移植術后缺血再灌注損傷、免疫激活、內(nèi)環(huán)境紊亂等可觸發(fā)機體炎性反應，產(chǎn)生大量細胞因子。目前CsA致肝損傷是否與細胞因子相關國內(nèi)外均未見報道，CsA致肝損傷的機制是否與IL-4、IL-10相關尚不明確。因此，本課題在前期研究的基礎上，繼續(xù)探討IL-4、IL-10與CsA致肝損傷的相關性，以期從多方面闡明CsA致肝損傷的發(fā)病機制。

本研究探討IL-4、IL-10基因多態(tài)性與腎移植受者CsA所致肝損傷的相關性。研究結(jié)果顯示，IL-4的rs2070874、rs2243250位點和IL-10的rs1800871、rs1800872、rs1800896位點等位基因及基因型分布在CsA所致的肝損傷組與對照組間無明顯差異，IL-10的C-A-A單倍型是CsA致肝損傷組的危險因素(P=0.013)，可使CsA致肝損傷的發(fā)生風險提高10.68倍，而IL-10其余單倍型及IL-4各單倍型與CsA所致肝損傷無明顯相關性(P>0.05)。IL-4 rs2070874和rs2243250位點相加模型及隱性模型的CsA血藥濃度在術后1個月有明顯差異(PAdd=0.002 3，PRec=0.003 2；PAdd=0.020 7，PRec=0.037 6)；在術后3個月，IL-10 rs1800872位點顯性模型的CsA血藥濃度有顯著性差異(Pdom=0.047 9)；而在移植術后其余時間點，IL-4、IL-10基因多態(tài)性對CsA血藥濃度無明顯影響(P>0.05)。

綜上所述，本研究探究IL-4基因的rs2070874、rs2243250位點及IL-10基因的rs1800871、rs1800872、rs1800896位點的基因多態(tài)性與腎移植術后CsA所致肝毒性的相關性，為尋求腎移植術后肝損傷的易感基因因素及術后合理用藥提供參考依據(jù)。