人子宮內(nèi)膜異位癥的可示蹤裸鼠模型構(gòu)建*

關(guān)綺蕙，史文靜，周龍書，李 露

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510260)

子宮內(nèi)膜異位癥(以下簡稱“內(nèi)異癥”)是指子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮體以外的部位，其治療方式主要有手術(shù)及藥物治療，其中藥物治療只能對癥治療而不能去除異位的內(nèi)膜細(xì)胞，而手術(shù)治療有較高的復(fù)發(fā)率[1]。因此，如何提高內(nèi)異癥的臨床治療效果是迫切需要解決的問題。目前國內(nèi)外已建立的內(nèi)異癥動物模型都存在一定的缺陷[2]，限制了基礎(chǔ)研究成果向臨床轉(zhuǎn)化的可能性。本文將內(nèi)異癥患者的在位子宮內(nèi)膜制成組織懸液，應(yīng)用慢病毒載體將熒光素酶和紅色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入子宮內(nèi)膜組織，并注射到裸鼠腹腔內(nèi)，以構(gòu)建可示蹤的內(nèi)異癥裸鼠模型，為內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制和新治療藥物的篩選及藥理藥效學(xué)研究提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 子宮內(nèi)膜組織均來自本院因卵巢巧克力囊腫合并子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)的在位子宮內(nèi)膜，所有患者術(shù)前3個(gè)月內(nèi)均未接受激素類藥物治療，既往未合并其他內(nèi)、外科疾病、免疫性及其他惡性疾??；36只無特殊病原體(SPF)級6～8周齡BALB/C雌性裸鼠購自中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量(16±4)g；LV-RFP-Luc購自上海漢恒生物有限公司，D-Luciferin購自美國Goldbio公司；小鼠抗人波形蛋白單克隆抗體-7(V-7)、小鼠抗人細(xì)胞角蛋白單克隆抗體-18(CK-18)均購自美國Santa Cruz公司；小鼠抗人單克隆抗體-CD34(CD34)購自廣州創(chuàng)科偉生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1子宮內(nèi)膜組織采集及體外病毒轉(zhuǎn)染 用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗新鮮收集的內(nèi)膜組織并將其剪碎為糊狀懸液。將其分為等體積的A、B兩組，分別接種于無菌六孔板內(nèi)，每孔加入含有20%胎牛血清和0.002 5 μg/mL 17β-雌二醇(E2)的DMEM/F12培養(yǎng)基2 mL，A組每孔加入含有終濃度5 μg/mL Polybrene滴度為1×108IU/mL的LV-RFP-Luc，并于體外轉(zhuǎn)染24 h；B組加入等體積的培養(yǎng)基。兩組均置入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后將兩組子宮內(nèi)膜組織培養(yǎng)液均換成含有20%胎牛血清和0.002 5 μg /mL E2的DMEM/F12培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)48 h后在熒光顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜組織塊的熒光表達(dá)情況。

1.2.2構(gòu)建動物模型 將裸鼠等數(shù)量分為A、B、C 3組,每組12只。3組中每只裸鼠分別于腹腔內(nèi)一次性注射等體積的已轉(zhuǎn)染的組織塊懸液、未轉(zhuǎn)染的組織塊懸液和DMEM/F12培養(yǎng)基。注射后參考文獻(xiàn)[3]肌內(nèi)注射E2(0.02 μg/d)。種植后每隔7天1次在活體成像儀下監(jiān)測異位病灶的發(fā)展情況。

1.2.3異位病灶的采集及形態(tài)和來源鑒定 于建模后第28天頸椎脫臼處死裸鼠，剖腹觀察異位病灶的生長情況并分離異位病灶。異位病灶分離后分別放入裝有4%多聚甲醛溶液的離心管中固定，并分別按試劑盒操作說明行蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組織化學(xué)鑒定。若HE染色病灶中有子宮內(nèi)膜腺體組織、間質(zhì)細(xì)胞及新生血管形成，且免疫組織化學(xué)鑒定子宮內(nèi)膜腺體組織和間質(zhì)細(xì)胞均來源于人類，則提示裸鼠內(nèi)異癥模型建模成功[4]。

2 結(jié) 果

2.1體外LV-RFP-Luc轉(zhuǎn)染情況及鑒定 (1)A組子宮內(nèi)膜組織體外培養(yǎng)至48 h在熒光顯微鏡下觀察示：子宮內(nèi)膜組織塊紅色熒光蛋白表達(dá)明亮，細(xì)胞陽性數(shù)率多(圖1C)；其快速冰凍切片可見典型的腺體結(jié)構(gòu)(圖1D)。(2)HE染色結(jié)果顯示：A組和B組的子宮內(nèi)膜組織塊均保持著完整的子宮內(nèi)膜腺體結(jié)構(gòu) (圖1A、B)。

A： A組組織；B：B組組織；C：A組組織塊；D：A組快速冰凍切片

圖1 子宮內(nèi)膜組織轉(zhuǎn)染情況(HE，×200)

2.2活體成像儀監(jiān)測異位病灶

2.2.1活體成像儀下異位病灶的熒光信號ROI表達(dá) 各組裸鼠在整個(gè)生長周期中，生長狀況良好，實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)裸鼠感染和(或)死亡等情況。A組11只裸鼠在活體成像下均能檢測到腹腔異位病灶發(fā)出的熒光信號；其中1只裸鼠于造模后第21、28天均未檢測到異位病灶的熒光信號。動態(tài)檢測到異位病灶發(fā)出熒光信號ROI值由第7天至第14天先變小，由第14天至第28天逐漸增大。而B組和C組均未檢測到異位病灶熒光信號(圖2)。

圖2 活體成像儀下異位病灶熒光信號ROI表達(dá)

2.2.2腹腔內(nèi)異位病灶發(fā)出熒光信號ROI值 異位病灶發(fā)出熒光信號的ROI值先減小后增大：第7、14、21、28天分別為(7.008±1.024)×106、(4.363±0.731)×106、(5.113±0.696)×106、(6.34±0.713)×106，第7天至第14天，熒光信號ROI值先減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；第14天至第28天，ROI值增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、4。

圖3 異位病灶ROI值趨勢的曲線圖

*：P<0.05；#：P<0.01；n=13

圖4 異位病灶ROI值的比較

2.2.3剖腹后裸鼠腹腔內(nèi)異位病灶形成情況 (1)A組中腹腔內(nèi)連續(xù)檢測到熒光信號的裸鼠剖腹后肉眼均可見透明紫色囊腫或白色硬結(jié)(圖5A白色單箭頭所指)，未見其他游離病灶。異位病灶周圍可見豐富血管形成或點(diǎn)狀出血，囊內(nèi)積聚暗紅黏稠液體(圖5B白色雙箭頭所指)。大部分異位病灶黏附于腸系膜、膀胱旁脂肪墊等處，且與周圍組織存在輕度粘連。另外1只于第21、28天均未能檢測到熒光信號的裸鼠剖腹后未見任何異位病灶，提示該個(gè)體造模失敗。(2)B組中所有裸鼠腹腔內(nèi)均可見透明紫色囊腫或白色硬結(jié)(圖5C白色單箭頭所指)，未見游離病灶。異位病灶周圍可見豐富血管形成，囊內(nèi)積聚清亮液體。大部分異位病灶黏附于腸系膜、膀胱旁脂肪墊等處，且與周圍組織存在輕度粘連(圖5D白色雙箭頭所指)，C組未見明顯異位病灶。

2.2.4異位病灶HE染色及免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果 (1)A、B兩組裸鼠的每個(gè)異位病灶均可見典型的內(nèi)膜腺體結(jié)構(gòu)，血管增殖豐富，未侵入腺泡腔。其組織學(xué)形態(tài)特征和人原發(fā)內(nèi)異癥的表現(xiàn)極為相似，無明顯病理學(xué)改變，且兩組的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)未見明顯異常(圖6A、B)。(2)A組和B組裸鼠腹腔中種植成功的異位病灶，間質(zhì)細(xì)胞質(zhì)、腺上皮細(xì)胞質(zhì)、血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)分別被V-7、CK-18、CD34染成棕黑色(見圖6C～H)。證明了移植的子宮內(nèi)膜組織并未改變子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞的特異性蛋白表達(dá)，確定異位病灶組織與人類的子宮內(nèi)膜組織同源，提示了可示蹤內(nèi)異癥動物模型建模成功。

A、B：A組裸鼠；C、D：B組裸鼠

圖5 A組和B組異位病灶

A、B：裸鼠的異位病灶組織形態(tài)(HE)；C、D：CK-18表達(dá)水平(免疫組織化學(xué))；E、F：V-7表達(dá)水平(免疫組織化學(xué))；G、H：CD34表達(dá)水平(免疫組織化學(xué))

圖6 A、B兩組異位病灶HE染色及免疫組織化學(xué)鑒定(×200)

2.2.5各組異位病灶成模率 A組異位病灶成模率為91.67%，B組異位病灶成模率為100.00%，C組未見任何異位病灶。

3 討 論

內(nèi)異癥可引起痛經(jīng)、性交痛、不孕等癥狀[5]，迄今為止其發(fā)病機(jī)制仍不明確。由于倫理學(xué)方面的約束，動物模型已成為研究發(fā)病機(jī)制和治療方法的主要途徑。動物模型可分為靈長類和嚙齒類動物，其中靈長類動物具有成模率低、費(fèi)用昂貴等問題，限制其在研究中的應(yīng)用。而嚙齒類動物具有費(fèi)用低廉、易于繁殖等優(yōu)點(diǎn)，因此可用于內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制及治療等方面的研究[6]。

目前應(yīng)用的嚙齒類內(nèi)異癥動物模型有大鼠自體移植模型和免疫缺陷小鼠異體移植模型。大鼠自體移植模型雖然存在很多優(yōu)點(diǎn)如易于生長、移植物無自身免疫抵抗等[7-8]，但移植物本身來源于實(shí)驗(yàn)動物，與人類的種屬差異性較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能直接應(yīng)用于人類。在免疫缺陷小鼠異體移植模型中，人子宮內(nèi)膜被直接種植于小鼠腹腔內(nèi)，移植的內(nèi)膜組織保留原來的組織形態(tài)和生化特性，可以在動物體內(nèi)研究人子宮內(nèi)膜的侵襲演變過程。GREAVES等[9]和 YAMAGATA等[10]將人子宮內(nèi)膜組織碎片或子宮內(nèi)膜細(xì)胞懸液，注射到裸鼠的腹腔中成功構(gòu)建內(nèi)異癥病灶。AGOSTINIS等[11]通過把卵巢巧克力囊腫患者的囊內(nèi)組織和在位內(nèi)膜的組織碎片，注射到SCID小鼠的腹腔內(nèi)，成功構(gòu)建內(nèi)異癥病灶。HE等[12]將人子宮內(nèi)膜細(xì)胞注射到裸鼠身上，成功構(gòu)建內(nèi)異癥病灶，成模率高達(dá)80%。

以往在內(nèi)異癥病灶發(fā)展的研究中，常根據(jù)在特定時(shí)間進(jìn)行開腹探查后所得的異位病灶體積、大小等來評價(jià)病灶發(fā)展情況[13-14]。該方法缺乏對同一病灶準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)的監(jiān)控，不能明確區(qū)分病灶與周圍組織，需在不同的時(shí)間點(diǎn)犧牲實(shí)驗(yàn)動物[15]。近年來，活體無創(chuàng)觀察方法備受關(guān)注。其原理是應(yīng)用病毒載體將熒光素酶或熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入子宮內(nèi)膜細(xì)胞或組織，把已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或組織種植于實(shí)驗(yàn)動物身上，運(yùn)用活體成像儀即可監(jiān)測異位病灶的位置及其大小[16]。FERRERO等[17]成功建立了內(nèi)異癥小鼠模型，通過無創(chuàng)監(jiān)測來研究內(nèi)異癥病灶早期的生長和進(jìn)展情況。WANG等[18]將含有紅色熒光蛋白基因的腺病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)膜細(xì)胞，然后將其注射于裸鼠皮下或腹腔內(nèi)，通過熒光掃描成像系統(tǒng)監(jiān)測病灶的生長情況。本實(shí)驗(yàn)方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，能實(shí)時(shí)監(jiān)測活體動物病灶的動態(tài)變化，避免了處死動物帶來的實(shí)驗(yàn)損耗，以及只能單次對同一個(gè)體進(jìn)行病灶生長情況評估等缺點(diǎn)，具有不可比擬的優(yōu)越性[19]。

本實(shí)驗(yàn)中HE染色及免疫組織化學(xué)結(jié)果證明了移植的內(nèi)膜組織并未改變其特異性蛋白表達(dá)，確定異位病灶組織與人子宮內(nèi)膜組織同源，與ZHAO等[20]報(bào)道相符。而通過活體成像系統(tǒng)監(jiān)測到的異位病灶熒光信號ROI值先減小后增大，與SOHNGEN等[21]和GROOTHUIS等[22]報(bào)道相符?？墒聚櫟膬?nèi)異癥裸鼠模型造模成功。

與以往的大鼠自體移植法建模及有創(chuàng)測量法相比，本方法采取人的子宮內(nèi)膜組織建立模型，減少了因物種差異帶來的結(jié)果偏差；使用無創(chuàng)的監(jiān)測手段，減少實(shí)驗(yàn)動物損耗，可連續(xù)、實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確地觀察病灶的生長情況。本研究通過建立可靠、重復(fù)性強(qiáng)、可示蹤的內(nèi)異癥動物模型，為研究內(nèi)異癥提供堅(jiān)實(shí)的研究平臺，可廣泛應(yīng)用于臨床前內(nèi)異癥新藥療效測試及內(nèi)異癥的發(fā)生機(jī)制研究。