雞TIGAR基因真核表達質粒的構建及其抗凋亡功能評價

栗永華，車路平，仇旭升，譚磊，孫英杰，劉煒煒，宋翠萍，廖瑛，丁鏟，王金泉，孟春春

（1新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052；2中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

0 引言

【研究意義】新城疫（newcastle disease，ND）是危害我國養(yǎng)禽業(yè)嚴重疫病之一，研究表明新城疫病毒（NDV）可誘導受感染細胞中 caspase依賴的內源性和外源性凋亡途徑[1]，從而產生病變效應[2]。細胞凋亡的特征是細胞形態(tài)和生化變化，包括細胞膜泡、caspase活化和DNA斷裂[3]。P53抑癌蛋白在細胞應激反應和抑制惡性發(fā)展中起著重要作用，P53抑癌蛋白通過協(xié)調 DNA修復、誘導細胞周期阻滯、凋亡、衰老和維持基因組穩(wěn)定性等多種機制調節(jié)腫瘤細胞的增殖和侵襲力[4]，防止腫瘤的形成[5-8]。【前人研究進展】BENSAAD等提出p53在細胞代謝中起著直接作用，TP53誘導的糖酵解和凋亡調節(jié)因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator，TIGAR）是p53下游的靶基因，具有調節(jié)糖酵解和抗氧化作用的蛋白[9]。在細胞中 TIGAR表達降低了果糖-2,6-二磷酸的水平來抑制磷酸果糖激酶(PFK)，進而有利于果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate，F-6-P）和葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphatase，G-6-P）的形成，從而抑制了糖酵解[5]。TIGAR可通過增加磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway, PPP）[10-12]，促進還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）的產生，從而去除活性氧（Reactive oxygen species，ROS）[13]，研究證實 ROS 在 p53 介導的細胞凋亡中有著重要調節(jié)作用，可以由多種途徑抑制細胞生長、誘發(fā)細胞凋亡[14-15]、自噬[16-18]。YE等用RNA干擾沉默HepG 2細胞中的TIGAR mRNA后，主要通過細胞凋亡和自噬作用抑制細胞生長[19]。細胞內ROS水平的降低而導致細胞對p53以及其他與ROS相關凋亡信號的敏感性[11,20-21]。TIGAR可以在缺氧條件下與線粒體的己糖激酶2形成復合體，從而提高己糖激酶2的活性，降低線粒體膜電位，減少ROS產生，保護細胞免受ROS的損傷并保持線粒體的完整性[22-24]。KO等在研究中表明 TIGAR在乳腺癌細胞中的表達促進了腫瘤的代謝分化和線粒體的乳酸和谷氨酰胺分解代謝，是一種很有潛力的乳腺癌治療方法[25]?！颈狙芯壳腥朦c】前人已擴增出人、鼠、牛等動物的TIGAR基因，并研究TIGAR的抗凋亡及在腫瘤的發(fā)生、增殖和轉移中發(fā)揮的重要作用。本研究首次從SPF雞的脾臟中擴增出雞的TIGAR基因，并研究了其抗凋亡的作用?！緮M解決的關鍵問題】驗證本研究擴增出的TIGAR是否具有抗凋亡功能，過表達 TIGAR基因后再感染病毒是否可以增加病毒滴度，并有利于病毒感染細胞的存活；為后續(xù)構建過表達TIGAR的細胞系和篩選適合新城疫病毒繁殖的高產細胞株提供前期基礎。

1 材料與方法

試驗于 2018年在中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所完成。

1.1 試驗材料

限制性內切酶（EcoR I、BamH I）、Trizol、Alexa FlourTM 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit為Thermo公司產品，Taq聚合酶、dNTP、T4DNA連接酶為諾唯贊公司產品，M-MLV、RNasin、FuGen為Promega公司產品，DH5α感受態(tài)細胞為天根公司產品，ECL發(fā)光液為圣爾公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 RT-PCR擴增TIGAR全長 取SPF雞的脾臟，加PBS反復研磨3次，7 000 r/min離心10 min，取上清。采用Trizol裂解細胞提取RNA，加入隨機引物 6nt和 Olig18t各 1 μL，70℃10 min，冰浴 5 min，按照 Promega公司試劑盒的操作方法逆轉錄為cDNA，反轉錄的溫度為37℃ 2 h、42℃ 2 h，75℃ 5 min滅活。根據 GenBank（GenBank登錄號：XM_417232.6）上預測的原雞 TIGAR序列設計并合成上游引物（5′-CCGGAATTCATGGTTCGCTTCGGG CTGACC-3′，限制性內切酶為EcoR I）和下游引物（5′-CGCG GATCCGAACATTTTCGGAGCTACACA TTCAGCACC-3′，限制性內切酶為BamH I），以 cDNA為模板利用PCR擴增出雞TIGAR的CDS區(qū)（擴增程序：95℃ 預變性30 s，95℃變性10 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min進行30個循環(huán)，72℃延伸10 min）。PCR結束后，產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳并在紫外燈下觀察，用膠回收試劑盒收集PCR產物，并送至上海生物工程公司測序。

1.2.2 繪制哺乳動物、水生動物的TIGAR基因進化樹TIGAR基因位于12號染色體短臂1區(qū)3帶3亞帶，含6個可能編碼外顯子的區(qū)域和2個P53結合位點[9,26-27]，BENSAAD發(fā)現在脊椎動物中（從魚到人）高度保守[9]。利用GenBank上找到脊椎動物的TIGAR基因以及本研究擴增的TIGAR基因構建進化樹。

1.2.3 質粒轉染DF1細胞 在200 μL的Opti-MEM轉染試劑中加入6 μL FuGen，室溫靜置5 min，再加入Flag-TIGAR或Flag-CMV14 2 μg，輕輕混勻，室溫靜置20 min后加入6孔板中，于37℃培養(yǎng)4—6 h，更換成10%DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 TIGAR蛋白表達檢測和PARP檢測 將細胞接種至6孔板（細胞密度為1×105），待細胞長至70%時轉染 2 μg重組質粒（Flag-TIGAR）和空載體（Flag-CMV14），轉染24 h后感染Herts33（1MOI），在感染后18、24、30、36 h收集樣品，每孔加入200 μL 2×Loading Buffer裂解細胞，收集入離心管，100℃煮樣10 min，12 000 r/min離心3 min。取等量樣品上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，電轉移至硝酸纖維素膜上，加入5%脫脂乳室溫封閉2 h；按照1:1 000稀釋一抗（Flag、NP、PARP）4℃封閉過夜，用TBST洗膜3次，每次10 min；按照1:5 000稀釋二抗室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。用化學發(fā)光法顯色。

1.2.5 流式檢測細胞凋亡 將細胞接種至6孔板（細胞密度為1×105），待細胞長至70%時分別轉染重組質粒（Flag-TIGAR）和空載體（Flag-CMV14），轉染后24、48 h收集細胞，用PBS洗后，加500 μL不含EDTA的胰酶消化2 min，用PBS吹下細胞并收集入離心管中，4℃1 000 r/min離心5 min，棄上清，用預冷的PBS洗3次，加入500 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，分別加入5 μL PI（用1×Binding Buffer做10倍稀釋）、25 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min，用流式儀檢測細胞凋亡情況。

2 結果

2.1 TIGAR的擴增及遺傳進化分析

擴增的全長TIGAR基因經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示擴增片段大小為 843 bp，與預期結果相符（圖1）。

本研究擴增的TIGAR基因全長3 206 bp，CDS區(qū)843 bp編碼281個氨基酸，已上傳至GenBank并獲得登錄號（MH511993.1），將擴增的雞TIGAR基因的序列與其他脊椎動物的TIGAR基因的序列進行比對并構建進化樹（圖2），發(fā)現TIGAR基因在脊椎動物中高度保守。

圖1 RT-PCR擴增雞TIGAR基因Fig. 1 Amplification chicken TIGAR gene with RT-PCR

2.2 Flag-TIGAR真核質粒的鑒定

將Flag-TIGAR重組質粒和空載轉染至DF1細胞系中，轉染后24、36、48 h的樣品利用Western Blot檢測蛋白表達情況，結果顯示轉染重組質粒的樣品在30 kD的位置出現了條帶，大小與預期結果一致；轉染空載體（Flag-CMV14）和未轉染細胞的樣品未出現條帶，表明Flag-TIGAR重組質粒構建成功（圖3）。

2.3 Western Blot檢測PARP

將Flag-TIGAR重組質粒和空載轉染至DF1細胞系中，轉染后 24 h 感染 Herts/33（1MOI），Western Blot檢測NP、FLAG、PARP的表達情況，結果顯示轉染重組質粒的樣品均表達TIGAR；感染組均表達NP；在30 h、36 h的樣品中PARP均有裂解條帶且轉染重組質粒（Flag-TIGAR）的樣品裂解出PARP的表達量明顯低于未轉染質粒（MOCK）組的樣品，且差異極顯著（P＜0.01）（圖4）。

圖2 哺乳動物、水生動物的TIGAR基因的進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of TIGAR gene in mammals and aquatic animals

2.4 FCM檢測轉染TIGAR對細胞凋亡的影響

將Flag-TIGAR和Flag-CMV14轉染入DF1細胞，在轉染后24、48 h收集細胞用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況（收集樣品前2 h用藥物Staurosporine誘導細胞凋亡，按照1：1 000的比例使用）。結果顯示，24 h轉染Flag-CMV14后細胞總凋亡率為11%（早期凋亡7.8%，晚期凋亡3.2%），而轉染Flag-TIGAR后細胞總凋亡率為4%（早期凋亡3.7%，晚期凋亡0.3%），轉染 Flag-CMV14的早期凋亡率和晚期凋亡率均高于轉染 Flag-TIGAR組，且差異顯著（P＜0.05）；48 h轉染Flag-CMV14后細胞總凋亡率為20.3%（早期凋亡14.3%，晚期凋亡6.0%），而轉染Flag-TIGAR后細胞總凋亡率為6.4%（早期凋亡4.8%，晚期凋亡1.6%），轉染 Flag-CMV14的早期凋亡率和晚期凋亡率均高于轉染Flag-TIGAR組，且差異極顯著（P＜0.01）（圖5）。

圖3 Flag-TIGAR真核質粒表達(Flag抗體)Fig. 3 Expression of Flag-TIGAR with Western Blot（Flag antibody）

圖4 Western Blot檢測PARP表達Fig. 4 Detection PARP expression with Western Blot

3 討論

TIGAR是具有調節(jié)糖酵解和抗氧化作用的蛋白，是存在于機體內的p53基因誘導的糖酵解和凋亡調節(jié)因子，通過抑制糖酵解途徑，增加磷酸戊糖途徑（PPP），可產生大量的5-磷酸核糖，是DNA修復和合成的重要原料[26]；還可以通過維持還原型谷胱甘肽所需的 NADPH水平來調節(jié) ROS水平，保護細胞免受ROS的損傷并保持線粒體的完整性，細胞內NADPH升高，活性氧（ROS）和自噬活性降低，因此 TIGAR既可以抑制細胞凋亡又抑制自噬[21, 28]。

本試驗利用雞脾臟組織cDNA為模板擴增出雞的TIGAR基因，經測序分析后，并將TIGAR基因序列上傳至GenBank。本研究通過檢測凋亡蛋白（PARP）以及流式檢測，結果表明擴增的雞 TIGAR基因具有抗凋亡的功能。

圖5 FCM檢測細胞凋亡率Fig. 5 Detection the rate of apoptosis with FCM

研究表明TIGAR在抗細胞凋亡及在腫瘤的發(fā)生、增殖和轉移中發(fā)揮的重要作用。周駿浩通過試驗預測 TIGAR在腦預適應中的作用可能是中風預防和治療[29]。細胞自噬是真核細胞內維持細胞自穩(wěn)態(tài)的正常的分解代謝活動， 通過溶酶體將長壽蛋白、損傷的細胞器以及外源病原微生物吞噬、降解的過程,是機體內一種重要的保護和防御機制。馮婧等干擾TIGAR蛋白后，細胞色素c在胞質內含量明顯增加而在線粒體內含量減少，且干擾組細胞凋亡率明顯升高，表明細胞凋亡增加；并檢測細胞中自噬標志蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin1表達顯著上升，同時P62表達下降，表明細胞自噬增強[30]。細胞發(fā)生凋亡后不利于病毒在細胞內的復制[31-33]，所以本研究為建立一株抑制病毒凋亡和自噬，利于病毒復制的細胞系奠定了前期基礎。

4 結論

首次擴增出雞的 TIGAR基因，并對其功能進行研究，確認其具有抗凋亡的作用。為進一步研究雞TIGAR基因在減少細胞凋亡，促進細胞增殖能力方面的研究提供了借鑒。

[1] RAVINDRA P V, TIWARI A K, RATTA B, BAIS M V, CHATURVEDI U,PALIA S K, SHARMA B, CHAUHAN R S. Time course of Newcastle disease virus-induced apoptotic pathways.Virus Research, 2009,144(1-2): 350-354.

[2] RAVINDRA P V, TIWARI A K, RATTA B, CHATURVEDI U, PALIA S K, CHAUHAN R S. Newcastle disease virus-induced cytopathic effect in infected cells is caused by apoptosis.Virus Research, 2009,141(1): 13-20.

[3] KERR J F, WYLLIE A H, CURRIE A R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.British Journal of Cancer,1972, 26(4): 239-257.

[4] 趙明, 馮婧, 劉勇, 楊玲麟. TIGAR調節(jié)肺癌細胞的增殖和侵襲能力研究. 國際檢驗醫(yī)學雜志, 2016(06): 754-755.ZHAO M, FENG J, LIU Y, YANG L L. TIGAR promotes proliferation and invasiveness of lung cancer cells.International Journal of Laboratory Medicine,2016(06): 754-755. (in Chinese)

[5] GREEN D R, CHIPUK J E. p53 and metabolism: Inside the TIGAR.Cell,2006, 126(1): 30-32.

[6] VOGELSTEIN B, LANE D, LEVINE A J. Surfing the p53 network.Nature, 2000, 408(6810): 307-310.

[7] SHEN M, ZHAO X, ZHAO L, SHI L, AN S, HUANG G, LIU J. Met is involved in TIGAR-regulated metastasis of non-small-cell lung cancer.Molecular Cancer, 2018, 17(1): 88.

[8] ROMEO M, HUTCHISON T, MALU A, WHITE A, KIM J,GARDNER R, SMITH K, NELSON K, BERGESON R, MCKEE R,HARROD C, RATNER L, LUSCHER B, MARTINEZ E, HARROD R. The human T-cell leukemia virus type-1 p30(II) protein activates p53 and induces the TIGAR and suppresses oncogene-induced oxidative stress during viral carcinogenesis.Virology, 2018, 518(10): 3-15.

[9] BENSAAD K, TSURUTA A, SELAK M A, VIDAL M N, NAKANO K, BARTRONS R, GOTTLIEB E, VOUSDEN K H. TIGAR, a p53-inducible regulator of glycolysis and apoptosis.Cell,2006,126(1): 107-120.

[10] YU H P, XIE J M, LI B, SUN Y H, GAO Q G, DING Z H, WU H R,QIN Z H. TIGAR regulates DNA damage and repair through pentosephosphate pathway and Cdk5-ATM pathway.Scientific Reports,2015. DOI: 10.1038/srep09853

[11] ZHOU J H, ZHANG T T, SONG D D, XIA Y F, QIN Z H, SHENG R.TIGAR contributes to ischemic tolerance induced by cerebral preconditioning through scavenging of reactive oxygen species and inhibition of apoptosis.Scientific Reports, 2016. DOI: 10.1038/srep27096.

[12] JIANG L B, CAO L, MA Y Q, CHEN Q, LIANG Y, YUAN F L, LI X L, DONG J, CHEN N. TIGAR mediates the inhibitory role of hypoxia on ROS production and apoptosis in rat nucleus pulposus cells.Osteoarthritis and Cartilage, 2018, 26(1): 138-148.

[13] KIM J, DEVALARAJA-NARASHIMHA K, PADANILAM B J.TIGAR regulates glycolysis in ischemic kidney proximal tubules.American Journal of Physiology Renal Physiology,2015, 308(4).DOI:10.1152/ajprenal.00459.2014F298-308.

[14] 付托. 過表達人TIGAR的CHO細胞株構建及其抗凋亡機制研究[D]. 蘇州: 蘇州大學, 2013.FU T. Establishment of CHO cell line overexpressing hTIGAR and mechanism of anti-apoptosis effect[D]. Suzhou: Suzhou University,2013. (in Chinese)

[15] HWANG S O, LEE G M. Nutrient deprivation induces autophagy as well as apoptosis in Chinese hamster ovary cell culture.Biotechnology and Bioengineering, 2008, 99(3): 678-685.

[16] WANG H, CHENG Q, LI X, HU F, HAN L, ZHANG H, LI L, GE J,YING X, GUO X, WANG Q. Loss of TIGAR induces oxidative stress and meiotic defects in oocytes from obese mice.Molecular & Cellular Proteomics, 2018. DOI: 10.1074/mcp.RA118.000620.

[17] LI B, WANG Z, XIE J M, WANG G, QIAN L Q, GUAN X M, SHEN X P, QIN Z H, SHEN G H, LI X Q, GAO Q G. TIGAR knockdown enhanced the anticancer effect of aescin via regulating autophagy and apoptosis in colorectal cancer cells.Acta Pharmacologica Sinica,2018. DOI: 10.1038/s41401-018-0001-2.

[18] KUMAR B, IQBAL M A, SINGH R K, BAMEZAI R N. Resveratrol inhibits TIGAR to promote ROS induced apoptosis and autophagy.Biochimie,2015, 118: 26-35.

[19] YE L, ZHAO X, LU J, QIAN G, ZHENG J C, GE S. Knockdown of TIGAR by RNA interference induces apoptosis and autophagy in HepG2 hepatocellular carcinoma cells.Biochemical and Biophysical Research Communications,2013, 437(2): 300-306.

[20] CHEUNG E C, LEE P, CETECI F, NIXON C, BLYTH K, SANSOM O J, VOUSDEN K H. Opposing effects of TIGAR- and RAC1-derived ROS on Wnt-driven proliferation in the mouse intestine.Genes & Development,2016, 30(1): 52-63.

[21] XIE J M, LI B, YU H P, GAO Q G, LI W, WU H R, QIN Z H. TIGAR has a dual role in cancer cell survival through regulating apoptosis and autophagy.Cancer Research,2014, 74(18): 5127-5138.

[22] CHEN J, ZHANG D M, FENG X, WANG J, QIN Y Y, ZHANG T,HUANG Q, SHENG R, CHEN Z, LI M, QIN Z H. TIGAR inhibits ischemia/reperfusion-induced inflammatory response of astrocytes.Neuropharmacology, 2018, 131: 377-388.

[23] CHEUNG E C, LUDWIG R L, VOUSDEN K H. Mitochondrial localization of TIGAR under hypoxia stimulates HK2 and lowers ROS and cell death.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(50): 20491-20496.

[24] FENG J, LUO L, LIU Y, FU S, CHEN J, DUAN X, XIANG L,ZHANG Y, WU J, FAN J, WEN Q, ZHANG Y, YANG J, PENG J,ZHAO M, YANG L. TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator is indispensable for mitochondria quality control and degradation following damage.Oncology Letters,2018, 15(1): 155-160.

[25] KO Y H, DOMINGO-VIDAL M, ROCHE M, LIN Z, WHITAKERMENEZES D, SEIFERT E, CAPPARELLI C, TULUC M, BIRBE R C, TASSONE P, CURRY J M, NAVARRO-SABATE A, MANZANO A, BARTRONS R, CARO J, MARTINEZ-OUTSCHOORN U. TP53-inducible glycolysis and apoptosis regulator (TIGAR) metabolically reprograms carcinoma and stromal cells in breast cancer.The Journal of Biological Chemistry,2016, 291(51): 26291-26303.

[26] 張騰, 袁梅, 俞同福. 腫瘤中 TP53誘導的糖酵解和凋亡調節(jié)因子及其靶向治療研究進展. 腫瘤, 2016(12): 1383-1388.ZHANG T, YUAN M, YU T F. Advances in TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator in tumor and its targeted therapy.TUMOR,2016(12): 1383-1388. (in Chinese)

[27] 顧志冬, 倪培華, 吳蓓穎, 吳華成, 樊綺詩, 肖家誠. TIGAR 基因真核表達載體的構建及在 HepG_2細胞中的作用初探. 診斷學理論與實踐, 2009(6): 617-622.GU Z D, NI P H, WU B Y, WU H C, FAN Y S, XIAO J C.Construction of TIGAR gene eukaryotic expression vector and effect of TIGAR expression in HepG2 cells.Journal of Diagnostics Concepts & Practice,2009(6): 617-622. (in Chinese)

[28] MA T, ZHANG Y, ZHANG C, LUO J G, KONG L Y. Downregulation of TIGAR sensitizes the antitumor effect of physapubenolide through increasing intracellular ROS levels to trigger apoptosis and autophagosome formation in human breast carcinoma cells.Biochemical Pharmacology,2017, 143: 90-106.

[29] 周駿浩. TIGAR 通過清除活性氧和抑制凋亡參與腦預適應介導缺血耐受[D]. 蘇州: 蘇州大學, 2016.ZHOU J H. TIGAR contributes to ischemic tolerance induced by cerebral preconditioning through scavenging of reactive oxygen species and inhibition of apoptosis[D]. Suzhou: Suzhou University,2016. (in Chinese)

[30] 馮婧. TIGAR對鼻咽癌細胞自噬、凋亡及線粒體降解作用研究[D].瀘州: 西南醫(yī)科大學, 2018.FENG J. Study on autophagy, apoptosis and mitochondrial degradation in nasopharyngeal carcinoma cells induced by TIGAR[D]. Luzhou:Southwest Medical University, 2018. (in Chinese)

[31] 梁思佳, 黃金麗, 魏東軒, 劉洪波, 石春薇. 細胞自噬與人腸道病毒感染的研究進展. 華中科技大學學報(醫(yī)學版), 2018, 47(01):126-130.LIANG S J, HUANG J L, WEI D X, LIU H B, SHI C W. Advances in the study of autophagy and human enterovirus infection.Acta Medicinae Universitatis Scientiae et Technologiae Huazhong, 2018,47(01): 126-130. (in Chinese)

[32] 孟春春. ClassⅠ新城疫弱毒的毒力演化及自噬在新城疫病毒感染腫瘤細胞中的作用[D]. 北京: 中國農業(yè)科學院, 2012.MENG C C. ClassⅠ virulence evolution of attenuated Newcastle Disease virus and the role of autophagy in Newcastle Disease virus infection with tumor cells[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2012. (in Chinese)

[33] 陶冶, 任曉峰. 細胞自噬與病毒感染. 病毒學報, 2013, 29(01):76-84.TAO Y, REN X F. Autophagy and virus infection.Chinese Journal of Virology,2013, 29(01): 76-84. (in Chinese)