感染大腸桿菌F17湖羊羔羊脾臟中差異circRNA分析

鄒雙霞,金澄艷,鮑建軍,王悅，陳煒昊，吳天弋，王利宏，呂曉陽，高雯，王步忠，朱國強，戴國俊，師東方，孫偉,6

(1揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州225009；2南京新九州農牧科技有限公司，南京210000；3江蘇西來原生態(tài)農業(yè)有限公司，江蘇泰州225300；4揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州225009；5東北農業(yè)大學動物醫(yī)學院，哈爾濱150030；6揚州大學教育部農業(yè)與農產品安全國際合作聯合實驗室，江蘇揚州225009）

0 引言

【研究意義】羊大腸桿菌病是規(guī)?；驁鲎顬槌Ｒ姼甙l(fā)的細菌性疾病之一，傳統(tǒng)沿用的抗生素治療方案存在諸多缺陷。利用RNA-seq篩選與不腹瀉綿羊大腸桿菌病有關的circRNA是分析綿羊抗病分子機制的基礎，從而發(fā)現與抗病性狀相關的候選基因?！厩叭搜芯窟M展】環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種特殊的內源性非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA），是繼微小RNA（microRNA，miRNA）及長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）后的 RNA 家族又一研究新熱點[1]。SANGER 等[2]利用電鏡首先在植物感染的類病毒中發(fā)現了這些以共價鍵形成的閉合環(huán)狀單鏈 RNA 分子，它們具有高度的熱穩(wěn)定性。1990年，研究人員在釀酒酵母中發(fā)現 20S RNA 沒有自由的5' 端和3' 端，通過電鏡觀察發(fā)現，這是呈環(huán)形的RNA分子[3-4]。隨后人們陸續(xù)在丁型肝炎病毒中發(fā)現 circRNA[5]，也發(fā)現在小鼠的睪丸內含有性別決定基因（sex-determining region Y，Sry）轉錄而來的circRNA[6]，還證實了circRNA 也存在于人體細胞[7]。雖然很早就發(fā)現circRNA 廣泛存在于各種不同類型的細胞中，但在過去的幾十年里，circRNA的研究卻始終進展緩慢，其生成機制和表達調節(jié)機制目前尚不完全清楚[8]。長久以來，circRNA 被認為是pre-mRNA 加工過程中選擇性剪接產生的副產物。事實上僅很少的 circRNA 被發(fā)現是選擇性剪接過程中產生的外顯子[9]。最近的研究[10]發(fā)現，circRNA 不是mRNA 成熟過程中的副產物，而與mRNA一樣，是pre-mRNA 加工后的一個重要產物，并且circRNA 的加工機制能與 mRNA 形成競爭。同時，經典的剪切信號和剪切機制對于反向剪切來說也是必需的[11]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關于綿羊抗病方面的研究主要集中在疾病防治方面[12-13]，而重要的抗病分子機制研究卻鮮有報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用RNA-seq，首次篩選出對大腸桿菌F17菌株不腹瀉與腹瀉型個體中差異表達的circRNA，利用Miranda分析circRNA- miRNA-mRNA相互作用，尋找miRNA的靶基因，在此基礎上利用q-PCR進行驗證。本研究從circRNA層面上，加深了對綿羊拮抗大腸桿菌F17菌株的認識，同時有望確定綿羊拮抗大腸桿菌F17菌株的功能基因，解決中國地方羊品種對大腸桿菌病的抗病育種關鍵問題，為今后制訂抗大腸桿菌病遺傳選育策略奠定基礎和提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計和樣本采集

試驗用羊于2016年12月購自江蘇西來原生態(tài)農業(yè)有限公司。隨機選擇包括性別、生長發(fā)育良好、日齡體重相近的18只3日齡羔羊，并將羔羊全部隔離飼養(yǎng)。先用10%羔羊奶粉（不含有任何抗生素和微生態(tài)制劑）飼喂，以確保在試驗前適應飲食需要。5日齡時開始飼喂 12.5%羔羊奶粉和大腸桿菌 F17菌液（4.6×108CFU·mL-1），同時保證自由飲水。每天記錄羔羊糞便形態(tài)[14]，在部分羔羊持續(xù)腹瀉 2d后，將羔羊分為不腹瀉組和腹瀉組，并對羊進行安樂死。用RNAlater收集每只羔羊的肝臟、脾臟、十二指腸、空腸和回腸，并立即在液氮中冷凍帶回實驗室以進行RNA提取。因為主要研究羔羊的免疫狀態(tài)，而脾臟是動物體最大的免疫器官，所以選用脾臟這個器官作為試驗對象。

1.2 文庫建設和測序

分別從不腹瀉組和腹瀉組中選擇了3個典型樣本并從綿羊脾臟提取總RNA，使用NanoDrop 2000超微量分光光度計和Agilent 2100生物分析儀進行質控。用 Ribo-Zero TM試劑盒（Epicenter, Madison, WI,USA）除去核糖體RNA。將RNA片段化（平均長度約為 200bp），然后通過逆轉錄合成和純化 cDNA。使用Qubit?dsDNA HS測定試劑盒進行PCR擴增和純化后，選擇使用NEBNext?Ultra?RNA文庫制備試劑盒進行文庫構建。在上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司使用Illumina HiSeq 2500平臺，對文庫進行末端配對測序（測序讀長為150 bp）。

1.3 鑒定circRNA

circBase[15]數據庫中只收錄了人、小鼠、線蟲、矛尾魚和腔棘魚5個物種的circRNA序列。由于綿羊不屬于上述物種之一，使用 CIRI[16]軟件從頭預測circRNA。根據 circRNA在基因組上的位置，可以將circRNA分為以下 5類：exonic circRNA、intronic circRNA、antisense circRNA、sense overlapping circRNA、intergenic circRNA。

1.4 差異表達分析

差異表達分析旨在找出不同樣本間存在差異表達的circRNA，得到差異表達circRNA之后，對其來源基因做Gene Ontology（GO）和KEGG Pathway顯著性分析。DESeq[17]適用于有生物學重復的實驗，可以進行樣品組間的差異表達分析，獲得兩個生物學條件之間的差異表達circRNA列表；對于沒有生物學重復的實驗，則使用 edgeR[18]進行差異表達分析，獲得兩個樣品之間的差異表達circRNA列表。

1.5 GO和KEGG通路分析

對差異表達轉錄本進行GO富集分析，對其功能進行描述（結合GO注釋結果）。統(tǒng)計每個GO條目中所包括的差異轉錄本個數，并用 Fisher's exact test計算每個 GO條目中差異轉錄本富集的顯著性。KEGG[19]是有關 Pathway的主要公共數據庫，利用KEGG數據庫對差異轉錄本進行Pathway分析（結合KEGG注釋結果），并用Fisher's exact test計算每個Pathway條目中差異轉錄本富集的顯著性。

1.6 circRNA-miRNA-mRNA互作研究

circRNA可以作為 miRNA的靶標分子，受到miRNA的調節(jié)。由于circRNA包含多個miRNA結合位點，通過circRNA-miRNA相互作用分析，可以幫助解析作為海綿發(fā)揮作用的 circRNA的功能和作用機制。對于動物，使用Miranda[20-21]軟件來預測與miRNA結合的circRNA以及miRNA的靶基因，根據miRNA靶基因的功能注釋來闡明此部分circRNA的功能。

1.7 驗證差異轉錄本的表達水平

為驗證篩選的DE circRNA在拮抗過程中發(fā)揮的作用，筆者用q-PCR檢測了不腹瀉和腹瀉羔羊脾臟組織中DE circRNA和miRNA靶基因的表達水平，使用2-ΔΔCt方法將每個RNA的相對定量歸一化為GAPDH，circRNA的引物見表1。

表1 GAPDH，DE circRNA和mRNA的引物Table 1 The primer of GAPDH, DE circRNAs and mRNAs

1.8 統(tǒng)計分析

使用SPSS軟件（版本20.0）分析所有數據，使用單因素方差分析（ANOVA）分析差異轉錄本的相對表達量，并使用Tukey檢驗進行多重比較。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。每組包含3個樣品，每個試驗重復3次。

2 結果

2.1 綿羊脾臟中轉錄本的鑒定

在繪制參考序列后，鑒定出已知的 7 730個circRNA。由圖1可以看出，circRNA長度主要分布于200—900 bp，平均長度為1 943bp，GC含量大約在43.5%，統(tǒng)計circRNA的外顯子數目主要為2—4個。統(tǒng)計 circRNA序列中反向剪切位點的可變剪切信號（GT-AG）情況，并繪制圖形，結果見下圖 2。統(tǒng)計circRNA類型見下圖3，其中sense overlapping circRNA占92.11%，exonic circRNA占3.27%，intergenic circRNA占3.18%，intronic circRNA占0.88%，antisense circRNA占0.56%。將circRNA與基因元件進行比較，從而探索circRNA在基因組上的分布，統(tǒng)計各條染色體上或scaffold上預測得到的circRNA數目情況，并繪制圖形，結果見下圖4，其中主要分布在3條染色體上，分別是NC_019458.2（853）、NC_019459.2（772）、NC_019460.2（787）。

圖1 circRNA長度、GC含量、預測circRNA的外顯子數目統(tǒng)計Fig. 1 circRNA length, GC content, predicting the number of exons in circRNA

圖2 circRNA剪切信號統(tǒng)計Fig. 2 circRNA shear signal statistics

圖3 circRNA基因結構分布Fig. 3 circRNA gene structure map

2.2 分析和驗證差異轉錄本

利用FPKM值估計circRNA轉錄物的表達水平，可以看出circRNA轉錄本表達水平相對很低（圖5）。篩選出31個上調和29個下調的DE circRNA（圖6）為了進一步驗證 RNA-seq的可靠性，隨機選擇 6個DE circRNA，用q-PCR驗證它們在不腹瀉組和腹瀉組羔羊體內的相對表達水平，發(fā)現與RNA-seq結果一致（圖7），表明RNA-seq數據是可靠的。 這些分析還表明，高通量測序具有檢測低表達水平（0

圖4 circRNA在各條染色體上或scaffold上數目分布Fig. 4 Distribution of circRNA on various chromosomes or on scaffold

2.3 DE circRNA的GO功能注釋和KEGG PATHWAY富集分析

DE circRNA與GO 數據庫進行比對的結果表明，一共有60條circRNA被注釋和分類到297個功能亞類中。圖8顯示了3種分類中DE circRNA數目大于2的GO條目。結果顯示，綿羊oxidation-reduction process（GO:0055114）、transport（GO:0006810）、extracellular region（GO:0005576）、focal adhesion（GO:0005925）、extracellular exosome（GO:0070062）、extracellular space（GO:0005615）、zinc ion binding（GO:0008270）等7個功能亞類的circRNA較多，而其余的功能亞類的circRNA分布較少。DE circRNA與KEGG PATHWAY數據庫進行比對的結果表明，一共有 60條 circRNA被注釋和歸類到73個KEGG PATHWAY 中。圖8顯示了KEGG通路中DE circRNA數目大于2的KEGG條目。結果顯示，綿羊Estrogen signaling pathway（path:ko04915）、Protein processing in endoplasmic reticulum（path:ko04141）、Regulation of actin cytoskeleton（path:ko04810）等3個KEGG Pathway的circRNA較多，而其余的KEGG Pathway的circRNA分布較少。

圖5 circRNA和mRNA轉錄本表達水平箱線Fig. 5 circRNA and mRNA transcript expression level box plot

圖6 不腹瀉和腹瀉型羔羊之間差異表達的circRNAsFig. 6 circRNAs differentially expressed between lambs without diarrhea and diarrhea

圖7 DE circRNA在不腹瀉和腹瀉羔羊體內的相對表達水平Fig. 7 Relative expression levels of DE circRNA in lambs without diarrhea and diarrhea

2.4 circRNA-miRNA-mRNA靶標關系預測

由于circRNA包含多個miRNA結合位點，因此可以使用miRNA靶基因預測的方法鑒定與miRNA結合的 circRNA，筆者使用 Miranda軟件來預測與miRNA結合的circRNA以及miRNA的靶基因，根據miRNA靶基因的功能注釋來闡明此部分 circRNA的功能，預測詳細結果見表2。

3 討論

由于傳統(tǒng)的分子生物學方法對 circRNA數量和豐度的檢測能效都非常有限，因此一直以來circRNA被認為是 RNA異常剪接的產物[7]。近年來隨著生物信息學的快速發(fā)展和高通量測序技術的不斷革新，目前通過高通量測序和生物信息學分析已經在真核生物中鑒定了大量的 circRNA[6,22-23]，并發(fā)現circRNA可能在調控基因表達過程中發(fā)揮著重要作用[9,24-25]。研究發(fā)現大多數 circRNA包含有 miRNA結合位點，可以作為高效的競爭性內源RNA，有效吸附miRNA從而調控miRNA的靶基因[26-27]，其具有以下4種生物學功能：miRNA海綿作用[25-26]，作為蛋白質翻譯模板[28-29]，調控基因轉錄[30-31]以及通過競爭調控線性RNA的生成[32-33]。然而，迄今為止，關于羔羊腹瀉的circRNA，特別是綿羊的研究報道很少。湖羊是一種具有高繁殖力和對濕熱氣候適應性強的中國特有品種，可以全年在室內飼養(yǎng)。在這項研究中，筆者不僅提供了綿羊腹瀉過程中 circRNA的第一個概況，還研究了 circRNA在抗病過程中的可能作用。

表2 circRNA-miRNA-mRNA靶標關系預測Table 2 circRNA-miRNA-mRNA target relationship prediction

圖8 circRNA的GO功能注釋（上）KEGG PATHWAY富集分析（下）Fig. 8 GORNA PATHWAY enrichment analysis (down) of GO function annotation (up) of circRNA

長期以來，羔羊腹瀉對牧場造成了嚴重的經濟損失。在研究中，發(fā)現circRNA的表達水平很低。由于circRNA包含多個 miRNA結合位點，因此可以通過Miranda 軟件使用miRNA靶基因預測的方法鑒定與6個circRNA結合的5個miRNA，并鑒定出其中4個circRNA的母基因，分別為Btnl 1、GSTM1、NRAMP2、B2M。

Btnl 1是T細胞活化和免疫疾病的關鍵抑制因子[34]。Btnl 1的作用機制不同于Btnl 2，BtnlA1，它是通過反受體接合直接抑制T細胞活化[34-37]。研究發(fā)現Btnl基因可能是腸道炎癥的新型重要局部調節(jié)因子[38]。GSTM1編碼谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathione-S-transferase，GST）M1酶，參與肺癌各種致癌物質的排毒[39]，并且在保護細胞免受氧化應激方面發(fā)揮關鍵作用[40]。NRAMP2是一種金屬轉運蛋白，在錳缺乏的條件下，NRAMP2參與了高爾基體中Mn的再生，促進植物根系生長[41]。B2M編碼主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex, MHC）I類分子的β鏈，并在炎癥和腫瘤細胞中上調[42]。

筆者也使用Miranda 軟件預測了3個miRNA的靶基因，并且在不腹瀉和腹瀉組之間顯著差異表達，分別為 NEB、UBE3B、ADGRF2、LAMA1、LTF、MGAT5、TLN2、SLC25A29。

NEB基因編碼伴肌動蛋白，是細胞骨架基質的巨大蛋白組分，與骨骼肌肌小節(jié)中的粗細肌絲共存，NEB基因的突變是桿狀體肌病最常見的原因，約占50%[43]。泛素化需要3種酶的連續(xù)作用：活化酶（E1），結合酶（E2）和連接酶（E3）。UBE3B是泛素化連接酶（UBE3）成員之一，它和 E2結合酶的獨特組合提供了靶向特定蛋白質降解所需的高度底物特異性[44]。ADGRF2是粘附性G蛋白偶聯受體家族成員之一，在細胞間與細胞-基質的粘附過程中扮演重要角色[45]。LAMA1突變可能與Poretti-Boltshauser綜合征有關，有研究證明 LAMA1缺陷可導致細胞骨架形態(tài)的改變[46]。LTF是轉鐵蛋白家族基因的成員，其蛋白質產物能夠啟動宿主防御，抵抗廣泛的微生物感染，抗原活性[47]。MGAT5編碼的蛋白質屬于糖基轉移酶家族，它是參與調控糖蛋白寡糖生物合成的最重要的酶之一，細胞表面糖蛋白上寡糖的改變引起細胞粘著或遷移行為的顯著變化，這種酶的活性增加與侵襲性惡性腫瘤的發(fā)展有關[48]。Talins是將粘附分子的整合素家族連接到 F-肌動蛋白的大的接頭蛋白，Talin 1對于整聯蛋白介導的細胞粘附是必需的，TLN2與Talin 1一樣，被認為與獨特的跨膜受體結合，在細胞外基質和肌動蛋白細胞骨架之間形成新的連接[49]。SLC25A29編碼核編碼的線粒體蛋白質，其是溶質運載體家族 25（SLC25）線粒體運載體大家族的成員，SLC25A29的主要生理作用是將堿性氨基酸導入線粒體，進行線粒體蛋白質合成和氨基酸降解[50]。

GO是一種廣泛用于研究基因功能關系的生物信息學工具。對60個DE circRNA進行GO分析，結果表明，綿羊 oxidation-reduction process（GO:0055114）、transport（GO:0006810）、extracellular region（GO:0005576）、focal adhesion（GO:0005925）、extracellular exosome（GO: 0070062）、extracellular space（GO:0005615）、zinc ion binding（GO:0008270）等7個功能亞類富集到的circRNA較多。KEGG Pathway分析表明，信號通路如Estrogen signaling pathway（path:ko04915）、Protein processing in endoplasmic reticulum（path:ko04141）、Regulation of actin cytoskeleton（path:ko04810）可能是DE circRNA參與調控的重要途徑，相關的 circRNA可能潛在地參與菌毛黏附腸道黏膜的過程。然而，這些通路在抗病過程中的作用很大程度上仍然是未知的。

筆者發(fā)現總共60個已知的circRNA在不腹瀉組和腹瀉組之間顯著差異表達，其中31個上調和29個下調。另外，我們確定了兩組中共有 1 942個新的circRNA。為了進一步驗證RNA-Seq結果，采用q-PCR驗證6個已知circRNA的表達水平，結果一致。

4 結論

通過對不腹瀉組和腹瀉組羔羊脾臟中circRNA表達譜的研究，了解其在綿羊抗病發(fā)生過程中具有調控作用。進一步發(fā)現 circRNA的差異表達，預測了與circRNA競爭性結合的miRNA及其靶基因，初步構建circRNA-miRNA-mRNA網絡互作模型。

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