硫?qū)湍干锔汇t過程中鉻脅迫的緩解作用

李函彤，甲承立，張書文，蘆晶，逄曉陽，劉鷺，呂加平

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100093；2北京市營養(yǎng)源研究所/系統(tǒng)營養(yǎng)工程技術(shù)研究中心，北京 100069）

0 引言

【研究意義】作為人體必需的微量元素，Cr（Ⅲ）可以促進(jìn)機(jī)體葡萄糖代謝，降低甘油三酯和游離脂肪酸含量，維持體內(nèi)糖脂代謝平衡[1]。酵母可以通過生物吸附和轉(zhuǎn)化作用將環(huán)境中的無機(jī)鉻轉(zhuǎn)化為有機(jī)鉻。這種來源于酵母的有機(jī)鉻也被稱為葡萄糖耐量因子（glucose tolerance factor，GTF）[2-4]，它具有吸收率高、安全性高的特點(diǎn)，被認(rèn)為是最安全的鉻補(bǔ)充劑[5]。但作為重金屬，Cr（Ⅲ）對(duì)酵母的生長有兩面性。一方面，低濃度的鉻可促進(jìn)酵母的生長；另一方面，高濃度的鉻可對(duì)酵母生長造成一定的氧化脅迫作用，抑制酵母的正常生命活動(dòng)、生長和GTF的生成。因此，研究釀酒酵母在富集 Cr（Ⅲ）形成葡萄糖耐量因子（GTF）過程中自身抗氧化機(jī)制以及硫在該過程中發(fā)揮的作用，對(duì)揭示硫降低鉻脅迫，進(jìn)而提高生物富鉻的作用機(jī)理具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】環(huán)境中的氧化還原劑或重金屬等能刺激細(xì)胞產(chǎn)生超氧負(fù)離子、羥基和過氧化氫等內(nèi)源性活性氧族物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）等代謝產(chǎn)物。這些代謝產(chǎn)物在細(xì)胞中累積到一定程度，可對(duì)DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等細(xì)胞組分造成一定的損害，進(jìn)而影響細(xì)胞的功能甚至造成細(xì)胞死亡[6]。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度 Cu2+會(huì)對(duì)酵母造成脅迫作用[7-8]，銅是氧化還原反應(yīng)的活潑因子，參與Fenton反應(yīng)[9]，產(chǎn)生有害的氫氧根離子[10]，氫氧根離子可引起細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)的氧化以及 DNA和RNA分子的解鏈，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[11]。重金屬會(huì)對(duì)生物造成氧化應(yīng)激，破壞 DNA結(jié)構(gòu)，抑制酶的功能，破壞蛋白質(zhì)在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和變異過程中的作用[12-13]。據(jù)報(bào)道，Cd（Ⅱ）、As（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）可以在酵母中產(chǎn)生ROS，誘導(dǎo)酵母體內(nèi)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)從而造成酵母細(xì)胞損傷[14-16]。有研究表明，Cr（Ⅲ）容易與酵母中 DNA和其他生物組分形成穩(wěn)定的胞內(nèi)配體，特別是與抗壞血酸鹽、組氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等[17]。劉鷺等[18]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中高濃度Cr（Ⅲ）（800 μg·mL-1）嚴(yán)重抑制菌體生長；而低濃度的 Cr（Ⅲ）（200—400 μg·mL-1）對(duì)菌體的生長具有輕微刺激作用，但有機(jī)鉻富集率較低。高氧化價(jià)態(tài)的金屬在硫的作用下可以轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛢r(jià)態(tài)[19]，硫的補(bǔ)充可以降低Cr（Ⅵ）對(duì)于酵母細(xì)胞的毒性，促進(jìn)酵母對(duì)廢水液中Cr（Ⅵ）的吸收[20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于 Cr（Ⅲ）對(duì)酵母在生成 GTF過程中產(chǎn)生的氧化脅迫作用鮮有報(bào)道，而針對(duì)緩解鉻的氧化脅迫作用、提高酵母富鉻含量的研究更少。本研究利用前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果對(duì)比分析了富鉻酵母和對(duì)照酵母的差異基因及其代謝通路，發(fā)現(xiàn)酵母富鉻過程與硫代謝和GSH代謝通路有密切的關(guān)系?；谝酝墨I(xiàn)報(bào)道硫吸收和 GSH生物合成相互聯(lián)系，并在緩解重金屬Cr（Ⅵ）對(duì)微生物的脅迫時(shí)發(fā)揮了重要的作用[21]，本研究擬在富鉻酵母發(fā)酵過程中添加不同種類的硫化合物，對(duì)比觀察富鉻酵母的生長，包括富集有機(jī)鉻、總鉻以及體內(nèi)氧化應(yīng)激的變化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)酵母富鉻代謝通路的分析結(jié)果，研究不同種類的硫?qū)湍父汇t以及體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響，揭示硫?qū)r（Ⅲ）脅迫下酵母生物富鉻調(diào)節(jié)機(jī)制，為酵母生物富集鉻生成 GTF的發(fā)酵條件優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株和對(duì)照菌株均為釀酒酵母YSI-3.7，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC No.2687）。YPD培養(yǎng)基（大豆蛋白胨 20 g，葡萄糖20 g，酵母浸粉10 g，蒸餾水1 L，pH 5.8，121℃，滅菌 15 min）的大豆蛋白胨和酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)公司；葡萄糖、無水亞硫酸鈉、硫化鈉，國藥集團(tuán)；硝酸、氨水和高氯酸，上海晶純科技公司；三氯化鉻（Ⅲ）六水化合物，上海阿拉丁公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以高產(chǎn)GTF的YSI-3.7為出發(fā)菌株，研究和分析不同濃度（0、200、500 和 800 μg·mL-1）Cr（Ⅲ）對(duì)酵母富集Cr（Ⅲ）情況及氧化應(yīng)激的影響，尋找酵母培養(yǎng)最適Cr（Ⅲ）濃度；在最適Cr（Ⅲ）濃度條件下（500 μg·mL-1），對(duì)比研究不同種類硫化合物（Na2SO3、Na2S、（NH4）2SO3）對(duì)緩解 Cr（Ⅲ）脅迫的氧化應(yīng)激的影響；在最適硫化合物及濃度下（1 mmol·L-1Na2SO3），測定酵母菌體生物量、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（CAT）、還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、谷胱甘肽氧化酶（GSH-PX）、總巰基、總抗氧化能力（T-AOC）等參數(shù)，探討硫?qū)r（Ⅲ）脅迫下酵母生物富鉻調(diào)節(jié)機(jī)制。

1.3 方法

1.3.1 富鉻酵母 YSI-3.7培養(yǎng) 將通過梯度鉻平板（200、500、800 和 1 000 μg·mL-1Cr（Ⅲ）篩選出的富鉻能力最強(qiáng)、生物量最大的釀酒酵母 YSI-3.7單菌落（有機(jī)鉻含量 1 033.91 μg·g-1DCW，總鉻含量 1 603.87 μg·g-1DCW，生物量 1.041 g/100 mL YPD）接種于YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第3代，然后以10%（v/v）接種量分別接種于含有一定鉻濃度的YPD培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)振蕩器中28℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)44 h。于4℃、6 000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌水洗滌3次，稱其濕重；-60℃冷凍干燥48 h得到凍干菌粉。

1.3.2 有機(jī)鉻、總鉻含量的測定 參考火焰原子吸收法[22]。

1.3.2.1 富鉻酵母菌體中有機(jī)鉻測定 富鉻酵母中有機(jī)鉻可溶于氨水，稱取0.1 g凍干酵母菌粉溶于10 mL 0.1 mol·L-1氨水溶液中，于37℃、200 r/min提取3 h。于4℃、5 000 r/min離心10 min，收集上清液于溶樣杯中，加入6 mL濃硝酸。將其置于加熱板于160℃預(yù)加熱30 min，再加入0.5 mL高氯酸和5 mL 5%（m/v）的過硫酸銨，進(jìn)行微波消解，參數(shù)如表 1所示。消解完全后用10% NH4Cl溶液定容至25 mL，參照GB/T15555.6—1995火焰原子吸收光譜法測定消化液中鉻含量，即為富鉻酵母菌體中有機(jī)鉻的含量。

1.3.2.2 富鉻酵母菌體總鉻測定 直接稱取0.1 g凍干菌粉于溶樣杯中，加入6 mL濃硝酸。將其置于加熱板于160℃預(yù)加熱30 min，再加入0.5 mL高氯酸和5 mL 5%（m/v）的過硫酸銨，進(jìn)行微波消解，微波消解參數(shù)設(shè)置如表1所示。消解完全后用10% NH4Cl溶液定容至25 mL，參照GB/T15555.6—1995火焰原子吸收光譜法測定消化液中鉻含量，即為富鉻酵母菌體的總鉻含量。

1.3.3 相關(guān)生理指標(biāo)的測定

1.3.3.1 丙二醛（MDA）含量 取菌體破壁、離心后的上清液，按照丙二醛（MDA）測試盒說明書步驟進(jìn)行。

1.3.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活力 取菌體破壁、離心后的上清液，按照超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.3.3.3 過氧化氫酶（CAT） 取菌體破壁、離心后的上清液，按照過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.3.3.4 谷胱甘肽（GSH，GSSG） 取菌體破壁、離心后的上清液，按照GSH和GSSG檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.3.3.5 總抗氧化能力（T-AOC） 取菌體破壁、離心后的上清液，按照 T-AOC檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.3.3.6 總巰基 取菌體破壁、離心后的上清液，按照巰基檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.3.3.7 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px） 取菌體破壁、離心后的上清液，按照谷胱甘肽檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS16.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果

2.1 Cr（Ⅲ）脅迫對(duì)酵母YSI-3.7生物富鉻及氧化應(yīng)激影響

2.1.1 生物量及富鉻情況 隨著培養(yǎng)液中 Cr（Ⅲ）濃度的升高，YSI-3.7菌體富集鉻的總量升高（包括有機(jī)鉻和總鉻），生物量下降。與對(duì)照組（Cr（Ⅲ）濃度為 0）酵母相比，200、500 和 800 μg·mL-1Cr（Ⅲ）濃度下酵母生物量分別降低 24.29%、30.71%和67.86%。在500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）濃度下，酵母中的有機(jī)鉻含量達(dá)到725.55 μg·g-1DCW，有機(jī)鉻率最高，達(dá)到57.79%；酵母于800 μg·mL-1Cr（Ⅲ）濃度下雖然吸附的總鉻高至1 812.22 μg·mL-1，但生物量降低較為嚴(yán)重，并且有機(jī)鉻率僅為29.59%（表1）。綜合考慮菌體生物量以及富集鉻的情況，Cr（Ⅲ）濃度為500 μg·mL-1為酵母發(fā)酵富鉻最佳濃度。

表1 Cr（Ⅲ）對(duì)酵母YSI-3.7生物量及生物富鉻的影響Table 1 Effect of Cr (Ⅲ) on YSI-3.7 growth and its chromium enrichment

2.1.2 Cr（Ⅲ）脅迫對(duì)酵母 YSI-3.7氧化應(yīng)激影響通過研究Cr（Ⅲ）脅迫對(duì)酵母YSI-3.7各氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響可知（表2），酵母細(xì)胞中丙二醛（MDA）的含量隨著培養(yǎng)基中 Cr（Ⅲ）濃度的增加而增加。MDA的量可以反映酵母細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。200、500和 800 μg·mL-1鉻濃度下，丙二醛含量分別比對(duì)照組增加31.36%、42.94%和52.49%。

隨著Cr（Ⅲ）濃度升高，YSI-3.7中SOD活力略有下降，在 200、500 和 800 μg·mL-1Cr（Ⅲ）濃度下，分別比對(duì)照組下降3.83%、7.90%和14.63%。在對(duì)照酵母中，CAT的活力可達(dá)到 9.09 U·mg-1prot，隨著Cr（Ⅲ）濃度升高，CAT活力有所下降，在200、500和800 μg·mL-1Cr（Ⅲ）濃度下，分別比對(duì)照組下降13.86%、48.07%和59.96%。

在對(duì)照酵母中，還原型谷胱甘肽（GSH）含量隨著Cr（Ⅲ）濃度升高，呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，GSH含量于 500 μg·mL-1Cr（Ⅲ） 濃度下達(dá)到最高 48.52 μmol·g-1prot。在 200、500 和 800 μg·mL-1Cr（Ⅲ） 濃度下，分別比對(duì)照組增加28.01%、54.42%和39.53%。與GSH變化趨勢不同，氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量隨著Cr（Ⅲ）濃度的升高而升高，在Cr（Ⅲ）濃度為800 μg·mL-1時(shí)含量達(dá)到最高，為15.46 μmol·g-1prot，比對(duì)照組增加96.69%。在Cr（Ⅲ）濃度為200、500 μg·mL-1時(shí)，GSSG 的含量也高于對(duì)照組，分別增加21.63%和57.51%。GSH/GSSG通常用來表示生物體的抗氧化能力。GSH/GSSG的比值在對(duì)照組中為4，在Cr（Ⅲ）濃度為200、500和800 μg·mL-1時(shí)分別為4.21、3.92和2.84。

Cr（Ⅲ）添加濃度為 200 和 500 μg·mL-1時(shí)，培養(yǎng)基中巰基含量分別比對(duì)照組提高 38.77%和 53.34%。在800 μg·mL-1Cr（Ⅲ）濃度下，巰基含量相對(duì)于對(duì)照組酵母降低約 7.19%。酵母細(xì)胞中總抗氧化能力(T-AOC)于 0—500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）濃度下持續(xù)升高。當(dāng)Cr（Ⅲ）濃度繼續(xù)升高至 800 μg·mL-1時(shí)，T-AOC比對(duì)照降低56.25%。培養(yǎng)基中Cr（Ⅲ）濃度從0升高到500 μg·mL-1時(shí)，酵母細(xì)胞中T-AOC持續(xù)升高，說明在此濃度范圍內(nèi)，Cr（Ⅲ）脅迫使酵母細(xì)胞的抗氧化能力提高，而當(dāng)Cr（Ⅲ）濃度升高至800 μg·mL-1時(shí)，酵母細(xì)胞的抗氧化能力降低，并且遠(yuǎn)低于對(duì)照組。說明高Cr（Ⅲ）對(duì)酵母造成了很大的破壞作用，酵母自身的抗氧化能力已經(jīng)不足以應(yīng)對(duì)此濃度下Cr（Ⅲ）的氧化脅迫。

2.2 不同硫化合物對(duì)鉻脅迫下酵母 YSI-3.7生物量及生物富鉻的影響

由表3可以看出，培養(yǎng)基中添加不同硫酸鹽培養(yǎng)的酵母細(xì)胞生物量（干重）幾乎均隨著其濃度的增加而減少。其中有機(jī)鉻含量隨著培養(yǎng)基中添加Na2SO3、Na2S、（NH4）2SO3濃度的升高先增加后減少，并分別在濃度5、1和1 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大值。對(duì)于培養(yǎng)基中添加 Na2SO3和（NH4）2SO3的酵母而言，酵母中總鉻含量隨著亞硫酸鹽添加濃度的升高先增加后減少，分別在5、15 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大值。而對(duì)于添加Na2S的酵母，其總鉻的含量在0.5—15 mmol·L-1濃度持續(xù)增加。對(duì)于培養(yǎng)基中添加 Na2SO3、Na2S的酵母，其有機(jī)鉻率均先上升后下降，且均在濃度為1 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大值，分別為對(duì)照的85.65%和67.75%。而對(duì)于添加（NH4）2SO3后發(fā)酵的酵母，其有機(jī)鉻率隨著其濃度升高而下降。結(jié)合細(xì)胞干重、有機(jī)鉻、總鉻、有機(jī)鉻率等指標(biāo)，當(dāng)在培養(yǎng)基中添加

1 mmol·L-1Na2SO3時(shí)，對(duì)于酵母富集Cr（Ⅲ）形成有機(jī)鉻最有利。此時(shí)，酵母細(xì)胞生物量為只添加 500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）的84.83%，總鉻含量提高31.03%，有機(jī)鉻率提高32.88%。綜上，選擇1 mmol·L-1Na2SO3進(jìn)行后續(xù)研究。

表2 Cr（Ⅲ） 對(duì)酵母細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響Table 2 Effect of Cr (Ⅲ) on YSI-3.7 oxidative stress

表3 硫化合物對(duì)釀酒酵母YSI-3.7生物量及生物富鉻的影響Table 3 Effect of various S compounds on YSI-3.7 biomass and its chromium enrichment

2.3 Na2SO3對(duì)酵母YSI-3.7富鉻及鉻脅迫下氧化應(yīng)激的影響

2.3.1 對(duì)應(yīng)激代謝產(chǎn)物的影響 氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，形成脂質(zhì)過氧化物，如丙二醛。MDA的量可以反映酵母細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。如圖1-A所示，500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理的酵母體內(nèi)MDA含量為16.91 nmol·mL-1，相比于空白組，提高了24.60%；1 mmol·L-1Na2SO3可有效降低因Cr（Ⅲ）引起的 MDA 含量，相比于500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理組，MDA含量降低了12.8%。

如圖1-B所示，500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理的酵母體內(nèi)巰基含量為 59.05 μg·g-1prot；1 mmol·L-1Na2SO3可促進(jìn)富鉻酵母體內(nèi)巰基含量的增加，達(dá)到 65.51 μg·g-1prot；相比于 500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理組，巰基含量提高了16.87%。

如圖1-C所示，500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理的酵母細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）含量為 48.52 μmol·g-1prot，相比于對(duì)照酵母組增加了54.42%。1 mmol·L-1Na2SO3可促進(jìn)富鉻酵母體內(nèi)GSH 增加至62.51 μmol·g-1prot。相比于空白組和500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理組分別提高98.95%和28.83%。

如圖 1-D 所示，500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理的酵母體內(nèi)氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量為 12.38 μmol·g-1prot，相比于空白酵母組增加 57.71%。1 mmol·L-1Na2SO3可促進(jìn)富鉻酵母體內(nèi) GSSG 降低至7.85 μmol·g-1prot。相較于 500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理組，GSSG降低了57.71%，與空白組酵母體內(nèi)GSSG含量近似。

圖1 Na2SO3對(duì)鉻脅迫下酵母氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物的影響Fig. 1 Effects of Na2SO3 on reactive oxygen species related intermediate metabolites by YSI-3.7

2.3.2 對(duì)酵母抗氧化能力的影響 金屬離子的氧化脅迫會(huì)激活微生物機(jī)體自身抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)，消除自由基，維持體內(nèi)自由基動(dòng)態(tài)平衡[23]。如圖2-A 所示，500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理的酵母體內(nèi)SOD含量為7.93 U·mg-1prot，相比于空白酵母組降低7.9%。1 mmol·L-1Na2SO3可促進(jìn)富鉻酵母體內(nèi)SOD 增加至 8.28 U·mg-1prot，比 500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）單獨(dú)處理組提高4.41%?？瞻讓?duì)照組中酵母的 CAT的活力達(dá)到 9.09 U·mg-1·prot；其他兩組處理相比，酵母細(xì)胞中 CAT活力無顯著變化（圖2-B），表明硫的添加對(duì)SOD、CAT的活力提高不明顯。

總抗氧化能力（T-AOC）是衡量機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)。它的大小可代表和反映機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)對(duì)外來刺激的代償能力以及機(jī)體自由基代謝的狀態(tài)。由圖2-C所示，在Cr（Ⅲ）脅迫下，酵母的總抗氧化能力有所提升，酵母發(fā)揮自身調(diào)節(jié)作用以對(duì)抗外界氧化脅迫作用；500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理的酵母體內(nèi)T-AOC含量為1.61 U·g-1prot，相比于空白酵母組提高 101.25%。1 mmol·L-1Na2SO3可促進(jìn)富鉻酵母體內(nèi)T-AOC增加至1.84 U·g-1prot，分別比空白酵母和500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理組中T-AOC含量提高130%和14.29%。表明硫的添加可以提高酵母的總抗氧化能力。

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）可以促進(jìn)過氧化氫（H2O2）與還原型谷胱甘肽反應(yīng)生成 H2O和氧化型谷胱甘肽（GSSG）。由圖2-D可知，500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理的酵母體內(nèi)GSH-Px含量為763.94 U·mg-1prot，相比于空白酵母組降低 26.86%。1 mmol·L-1Na2SO3可使富鉻酵母體內(nèi) GSH-Px增加至907.53 U·mg-1prot，比 500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理組提高18.80%。以上結(jié)果表明，硫的添加可以提高谷胱甘肽過氧化物酶的活力，促進(jìn)氧化氫（H2O2）與還原型谷胱甘肽反應(yīng)，促進(jìn)過氧化氫的分解。

圖2 Na2SO3對(duì)酵母抗氧化能力的影響Fig. 2 Effect of Na2SO3 on YSI-3.7 antioxidant capacity

3 討論

動(dòng)物、植物細(xì)胞在代謝過程中不斷產(chǎn)生自由基，這些自由基會(huì)被細(xì)胞本身具有的防御體系所清除，在正常生理?xiàng)l件下，二者之間始終處于動(dòng)態(tài)平衡。一旦平衡被打破，機(jī)體組織內(nèi)的活性氧自由基不斷聚積，使組織代謝功能出現(xiàn)異常并發(fā)生組織過氧化現(xiàn)象，從而引發(fā)一系列病理及生理變化[24]。過量的重金屬會(huì)誘導(dǎo)活性氧基團(tuán)（ROS）的產(chǎn)生，如超氧離子（O2-）、羥基(-OH)、過氧化氫（H2O2）等活躍的微粒。這些微粒能與大量細(xì)胞成分反應(yīng)，氧化核酸、蛋白質(zhì)、糖類和脂肪等大分子，引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[25]。鉻和其他金屬一樣，會(huì)顯著誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，可以直接或者間接地對(duì)生物體中核酸、葉綠體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜造成破壞[26]。PEREIAR等[27]在研究氧化脅迫與酵母抗逆性的關(guān)系時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在高溫、饑餓、金屬離子等逆境因子存在時(shí)可誘使酵母細(xì)胞產(chǎn)生活性氧ROS。ROS的清除主要包括非酶促和酶促兩種機(jī)制。其中，非酶促清除機(jī)制主要依賴于抗壞血酸、谷胱甘肽、類黃酮和生物堿等還原性物質(zhì)[28]；而酶促清除機(jī)制則依賴于超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶等[29]。KEUNEN 等[30]認(rèn)為，鉻（Ⅵ）主要通過硫轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞，并且競爭性地抑制硫的攝取，導(dǎo)致硫饑餓，從而引起硫攝取量的減少。在這兩者競爭下，硫的補(bǔ)充可以解除鉻的毒性，使酵母生長狀態(tài)變好，蛋白含量增加。GSH等含半胱氨酸殘基的巰基化合物，具有抗氧化、提高機(jī)體免疫、重金屬解毒，維持生物細(xì)胞特定的氧化還原氛圍等多種生物學(xué)功能，是生物細(xì)胞內(nèi)重要的活性物質(zhì)。硫在蛋白質(zhì)中的保存增加了GSH的合成。硫通路的激活，不僅可以控制GSH的合成，而且保存蛋白中的硫，為GSH的合成提供S原子。

3.1 Na2SO3對(duì)酵母膜脂質(zhì)過氧化程度的影響

六價(jià)鉻脅迫可能會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)的過氧化以及細(xì)胞膜損傷，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷[31-32]。在脅迫下，植物組織和器官膜脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物是丙二醛，細(xì)胞膜發(fā)生過氧化后細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)大量滲透。植物體內(nèi) MDA的含量和細(xì)胞膜透性可以一定程度上反應(yīng)植物受脅迫損傷的程度，也能反映細(xì)胞膜所受傷害程度的高低[33-34]。Cd2+脅迫可以使美人蕉 MDA 含量升高[35]，SHAH等[36]在Cd2+處理的兩種水稻品種中均檢測到了 MDA的積累。杜君等報(bào)道，銅脅迫可以使釀酒酵母膜脂過氧化程度加劇且細(xì)胞內(nèi)丙二醛含量隨著銅處理濃度的增加而增加[37]。Al3+作用可以造成煙草細(xì)胞的膜脂過氧化[38]，對(duì)酵母的毒性很大程度上也是膜脂過氧化造成細(xì)胞膜完整性和流動(dòng)性消失引起的[39]。本研究發(fā)現(xiàn)，酵母富鉻過程中，隨著 Cr（Ⅲ） 濃度的升高，酵母中 MDA含量上升，說明酵母細(xì)胞膜質(zhì)過氧化的程度升高，細(xì)胞膜所受傷害程度不斷加深。適當(dāng)濃度的 Na2SO3可以使酵母細(xì)胞中MDA含量降低，緩解細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的程度。有報(bào)道指出，H2S可以增強(qiáng)抗氧化酶活性，參與調(diào)節(jié)鹽脅迫下植物活性氧代謝，顯著降低O2-、H2O2和MDA含量，緩解鹽脅迫引起的氧化損傷[40-42]。

3.2 Na2SO3對(duì)酵母生物富鉻過程中抗氧化能力的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是細(xì)胞中最重要的清除自由基的酶之一，以為基質(zhì)進(jìn)行歧化反應(yīng)，將毒性較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化為毒性次級(jí)的H2O2和基態(tài)氧，避免毒性更大的·OH的生成。研究表明，Cd2+使美人蕉根部 SOD活性明顯增加，Cu2+對(duì)其活性無明顯影響[35]。釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶活性在不同濃度銅脅迫下有不同程度的升高[37]。本研究中添加 Na2SO3后酵母中 SOD活力比只添加 500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）略有上升，說明Na2SO3可以通過提高酵母 SOD活力抵抗鉻脅迫。本研究還發(fā)現(xiàn)，Cr（Ⅲ）可降低酵母體內(nèi) CAT含量，使酵母體內(nèi)過氧化氫分解能力減弱，外源添加 Na2SO3對(duì) CAT酶系沒有影響。杜君等[37]發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)氧化氫酶的活性在不同濃度銅脅迫下有不同程度的升高。三價(jià)鉻和銅對(duì)酵母過氧化氫酶影響不同，可能與酵母對(duì)不同種的金屬的抗氧化能力和途徑有所不同有關(guān)。

GSH是含半胱氨酸殘基的巰基化合物，具有抗氧化、提高機(jī)體免疫、重金屬解毒，維持生物細(xì)胞特定的氧化還原氛圍等多種生物學(xué)功能，是生物細(xì)胞內(nèi)重要的活性物質(zhì)[31]。生物體對(duì)重金屬的抗逆性、解毒及積累作用與生物細(xì)胞內(nèi)含有豐富的GSH和金屬硫蛋白等疏基化合物有關(guān)[42-45]。Fe3+、Cu2+、Cr（Ⅲ）這些變價(jià)離子在脅迫細(xì)胞時(shí)，與酵母細(xì)胞中的巰基化合物中巰基發(fā)生直接的配位作用[46]。有研究表明，鎘處理誘導(dǎo)了水稻根系產(chǎn)生大量的包括還原型谷胱甘肽在內(nèi)的含巰基物質(zhì)。谷胱甘肽幾乎是所有活細(xì)胞中抗氧化劑中最豐富的物質(zhì)。鉻對(duì)酵母細(xì)胞既然存在氧化脅迫，那么，酵母細(xì)胞內(nèi)必然也存在相應(yīng)的反應(yīng)機(jī)制來對(duì)抗或消除氧化毒性。研究結(jié)果說明低濃度的Cr（Ⅲ）可以刺激酵母產(chǎn)生GSH，抵抗氧化毒性。GSH被稱為生物體中抵抗重金屬壓力的緩解劑[47]。GSH在緩解氧化毒性中具有多種功能，如：動(dòng)物呼吸作用產(chǎn)生的 H2O2由線粒體中的谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）消除，而 GSH就是該酶的電子供體；在植物中，GSH也是活性氧自由基防御反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，并作為一種植物螯合肽底物，可以幫助植物應(yīng)對(duì)金屬毒性[48-50]，如抵抗氧化劑對(duì)巰基（-SH）的破壞，與α-生育酚協(xié)調(diào)清除細(xì)胞中積累的氧自由基。GSH還被發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母的熱激、H2O2、Hg、Cu等引起的氧化脅迫中起到關(guān)鍵作用[51-54]。谷胱甘肽在體內(nèi)以還原型(GSH)和氧化型(GSSG)兩種形式存在，正常時(shí)主要以還原型為主，具有清除自由基的能力，可在谷胱甘肽過氧化酶(GPx)的催化下與過氧化物、自由基等反應(yīng)，形成氧化態(tài)的 GSSG，GSSG又可在還原型輔酶Ⅱ(NADPH)和 GSH 還原酶(GSR)的作用下還原成GSH，形成一個(gè)循環(huán)，這個(gè)過程被認(rèn)為是谷胱甘肽最重要的抗氧化機(jī)制。此外，一些報(bào)道發(fā)現(xiàn)，GSH還具有其他抗性功能。有報(bào)道認(rèn)為，GSH可以保護(hù)一些同樣含巰基的蛋白質(zhì)及酶免受氧化，也可以作為一些酶的輔助因子或者具有調(diào)節(jié)相關(guān)氨基酸的運(yùn)輸?shù)裙δ躘55]。還有人發(fā)現(xiàn)，GSH可以直接與 Cd等金屬螯合形成復(fù)合物儲(chǔ)存到液泡中[13]，在植物中，GSH還是植物螯合肽的合成底物[7]。GSH/GSSG是氧化壓力的生物標(biāo)志[56]。隨著Cr（Ⅲ）濃度不斷升高（0—800 μg·mL-1），GSH/GSSG 分別為 4、4.2、3.9和 2.8，呈先升高后下降的趨勢，說明酵母對(duì)低濃度的Cr（Ⅲ）自身抗氧化能力較強(qiáng)，對(duì)高濃度的鉻抵抗力變?nèi)酢?/p>

總抗氧化能力（T-AOC）是衡量機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)。它的大小可代表和反映機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)對(duì)外來刺激的代償能力以及機(jī)體自由基代謝的狀態(tài)[57]。在低 Cr（Ⅲ）濃度下（≤500 μg·mL-1），機(jī)體自身氧化應(yīng)激調(diào)整，酵母細(xì)胞中總抗氧化能力升高；而高濃度Cr（Ⅲ）脅迫下，總抗氧化能力遠(yuǎn)低于對(duì)照組，酵母細(xì)胞的抗氧化能力降低，說明高Cr（Ⅲ）對(duì)酵母造成了很大的破壞作用，酵母自身氧化應(yīng)激的調(diào)整無法應(yīng)對(duì)此濃度下Cr（Ⅲ）的氧化脅迫。適當(dāng)濃度的 Na2SO3使酵母細(xì)胞 T-AOC進(jìn)一步升高，表明Na2SO3可以通過提高酵母總抗氧化能力防御Cr（Ⅲ）帶來的氧化作用。

4 結(jié)論

酵母在富集Cr（Ⅲ）形成GTF過程中，會(huì)受到Cr（Ⅲ）的氧化脅迫作用。較低濃度 Cr（Ⅲ）會(huì)刺激酵母細(xì)胞生長，而較高濃度的 Cr（Ⅲ）則會(huì)抑制其生長。酵母細(xì)胞的膜脂過氧化程度隨 Cr（Ⅲ）濃度的升高而加重。在較低濃度 Cr（Ⅲ）作用下，酵母自身可通過增加 T-AOC、GSH、巰基含量以及GSH-Px活力以防御 Cr（Ⅲ）的氧化脅迫。但在高Cr（Ⅲ）濃度下，有些未得到及時(shí)清除的自由基對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的傷害，使細(xì)胞膜脂過氧化程度大大加重，酵母自身無法抵抗其氧化脅迫作用。適當(dāng)濃度Na2SO3可以通過增加酵母中-SH、GSH、T-AOC含量，提高GSH-Px酶活力，降低膜脂過氧化程度，從而幫助酵母細(xì)胞抵御一定濃度的 Cr（Ⅲ）氧化脅迫作用，進(jìn)而提高有機(jī)鉻生成率。

[1] 徐晨晨. 微量元素鉻對(duì)營養(yǎng)代謝調(diào)控的研究進(jìn)展. 家禽科學(xué),2012(1): 12-15.XU C C. Research progress on the regulation of nutrient metabolism by trace element chromium.Poultry Science, 2012(1): 12-15. (in Chinese)

[2] YEH G Y, EISENBERG D M, KAPTCHUK T J, PHILLIPS R. S.Systematic review of herbs and dietary supplements for glycemic control in diabetes.Diabetes Care, 2003, 26(4): 1277-1294.

[3] HATFIELD M J, GILLESPIE S, CHEN Y, LI Z, CASSADY C J,VINCENT J B. Low-molecular-weight chromium-binding substance from chicken liver and American alligator liver.Comparative Biochemistry & Physiology, Part B, Biochemistry & Molecular Biology2006, 144(4): 423-431.

[4] CHEN Y, WATSON H M, GAO J, SINHA S H, CASSADY C J,VINCENT J. B. Characterization of the organic component of low-molecular-weight chromium-binding substance and its binding of chromium.Journal of Nutrition, 2011, 141(7): 1225-1232.

[5] BERNER T O, MURPHY M M, SLESINSKI R. Determining the safety of chromium tripicolinate for addition to foods as a nutrient supplement.Food & Chemical Toxicology, 2004, 42(6): 1029.

[6] MOLIN M, RENAULT J P, LAGNIEL G, PIN S , TOLEDANO M ,LABARRE J. Ionizing radiation induces a Yap1-dependent peroxide stress response in yeast.Free Radical Biology & Medicine, 2007, 43:136-144.

[7] LI H, GUO A, WANG H. Mechanisms of oxidative browning of wine.Food Chemistry, 2008, 108(1): 1-13.

[8] FERREIRA J, DU TOIT M, DU TOIT W J. The effects of copper and high sugar concentrations on growth, fermentation efficiency and volatile acidity production of different commercial wine yeast strains.Australian Journal of Grape & Wine Research, 2006, 12(1): 50-56.

[9] 廖蕓, 曾英杰, 許笑男, 鐘秋平, 趙久香. 銅離子對(duì)荔枝酒降酸酵母發(fā)酵性能及醋酸代謝的影響. 食品科技, 2014(10): 43-47.LIAO Y, ZENG Y J, XU X N, ZHONG Q P, ZHAO J X. Effect of copper ion on the fermentation performance and acetic acid metabolism of lychee wine yeast.Food Science and Technology,2014(10): 43-47. (in Chinese)

[10] PANDA S K. Impact of copper on reactive oxygen species, lipid peroxidation and antioxidants inLemna minor.Biologia Plantarum,2008, 52(3): 561-564.

[11] GAETKE L M, CHOW C K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients.Toxicology, 2003, 189(1/2): 147.

[12] LIN C C, KAO C H. Effect of NaCl stress on H2O2metabolism in rice leaves.Plant Growth Regulation, 2000, 30(2): 151-155.

[13] BRENNAN R J, SCHIESTL R H. Cadmium is an inducer of oxidative stress in yeast.Mutation Research,1996, 356(2): 171-178.

[14] MENEZES R A, AMARAL C, BATISTA-NASCIMMENTO L,SANTOS C, RODRIGUES-POUSADA C. Contribution of Yap1 towardsSaccharomyces cerevisiaeadaptation to arsenic-mediated oxidative stress.Biochemical Journal, 2008, 414(2): 301-311.

[15] BEYERSMANN D, HARTWIG A. Carcinogenic metal compounds:recent insight into molecular and cellular mechanisms.Archives of Toxicology, 2008, 82(8): 493-512.

[16] HARRIS G K, SHI X L. Signaling by carcinogenic metals and metal-induced reactive oxygen species.Mutation Research,2003,533(1): 183-200.

[17] BEYERSMANN D, HARTWIG A. Carcinogenic metal compounds:recent insight into molecular and cellular mechanisms.Archives of Toxicology, 2008, 82(8): 493-512.

[18] 劉鷺, 呂加平, 高艷紅. 空間搭載高產(chǎn)葡萄糖耐量因子(GTF)酵母的選育. 微生物學(xué)通報(bào), 2009, 36(2): 223-230.LIU L, Lü J P, GAO Y H. Breeding of high yield glucose tolerance factor (GTF) yeast in space.Microbiology, 2009, 36(2): 223-230. (in Chinese)

[19] ALEXANDER J, AASETH J. Uptake of chromate in human red-blood-cells and isolated rat-liver cells - the role of the anion carrier.Analyst, 1995, 120(3): 931-933.

[20] SUMMERS A O. Damage control: Regulating defenses against toxic metals and metalloids.Current Opinion Microbiology, 2009, 12(2):138.

[21] SALNIKOW K, ZHIKOVICH A. Genetic and epigenetic mechanisms in metal carcinogenesis and cocarcinogenesis: Nickel, arsenic and chromium.Chemical Research Toxicology, 2008, 21(1): 28-24.

[22] PEREIRA Y, LAGNIEL G, GODAT E, BAUDOUIN-CORNU P,JUNOT C, LABARRE J. Chromate causes sulfur starvation in yeast.Toxicological Sciences, 2008, 106(2): 400-412.

[23] 馮建永, 龐民好, 張金林, 劉穎超. 復(fù)雜鹽堿對(duì)黃頂菊種子萌發(fā)和幼苗生長的影響及機(jī)理初探. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 19(5): 77-86.FENG J Y, PANG M H, ZHANG J L, LIU Y C. Study on complex effects on saline flaveriabidentis seed germination and seedling growth and its mechanism.Acta prataculturae sinica, 2010, 19(5):77-86. (in Chinese)

[24] 高春生, 王春秀, 張書松. 水體銅對(duì)黃河鯉肝胰臟抗氧化酶活性和總抗氧化能力的影響. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 27(3): 1157-1162.GAO C S, WANG C X, ZHANG S S. Effect of water copper on antioxidant enzyme activity and total antioxidant capacity of hepatopancreas in the Yellow River carp.Journal of Agricultural Environmental Science, 2008, 27(3): 1157-1162. (in Chinese)

[25] GADJEV I, STONE J M, GECHEV T S. Programmed cell death in plants: new insights into redox regulation and the role of hydrogen peroxide.International Review of Cell & Molecular Biology, 2008,270: 87-144.

[26] TIWARI K, DWIVEDI K, SINGH S. Chromium (VI) induced phytotoxicity and oxidative stress in pea (Pisum sativumL.):Biochemical changes and translocation of essential nutrients.Journal of Environmental Biology, 2009, 30(3): 389.

[27] PEREIRA M D, HERDERIRO R S, FERNANDES P N,ELEUTHERIO E C A, PANEK A D. Targets of oxidative stress in yeastsodmutants.Biochinica et Biophysica Acta, 2003, 1620(1-3):245-251.

[28] APEL K, HIRTIRT H. Reactive oxygen species: Metabolism,oxidative stress and signal transduction.Annual Review of Plant Biology, 2004, 55: 373-399.

[29] MITTLER R, VANDERAUWERA S, GOLLERY M, BREUSEGEM F V. Reactive oxygen gene network of plants.Trends in Plant Science,2004, 9(10): 490-498.

[30] KEUNEN E, REMANS T, BOHLER S, VANGRONSVELD J,CUYPERS A. Metal-induced oxidative stress and plant mitochondria.International Journal of Molecular Sciences,2011, 12(10): 6894-6918.

[31] MANGABEIRA P A, FERREIRA A S, DE ALMEIDA A A F,FERNANDES V F, LUCENA E, SOUZA V L, DOS SANTOS JúNIOR A J, OLIVEIRA A H, GRENIER-LOUSTALOT M F,BARBIER F, SILVA D C. Compartmentalization and ultrastructural alterations induced by chromium in aquatic macrophytes.Biometals,2011, 24(6):1017-1026.

[32] DAUD M K, MEI L, VARIATH M T, ALI S, LI C, RAFIQ M T, ZHU S J. Chromium (VI) uptake and tolerance potential in cotton cultivars:Effect on their root physiology, ultramorphology, and oxidative metabolism.Biomed Research International, 2014, 2014(2): 975946.

[33] 趙風(fēng)斌, 王麗卿, 季高華, 李為星. 鹽脅迫對(duì) 3種沉水植物生物學(xué)指標(biāo)及葉片中丙二醛含量的影響. 環(huán)境污染與防治, 2012, 34(10):40-44.ZHAO F B, WANG L Q, JI G H, LI W X. Effects of salt stress on the biological indexes of 3 submerged plants and the content of malondialdehyde in leaves.Environmental Pollution and Prevention,2012, 34(10): 40-44. (in Chinese)

[34] 孟衡玲, 張薇, 盧丙越, 何芳芳, 魯海菊. 金銀花幼苗對(duì)鹽脅迫的生理響應(yīng). 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 43(4): 247-249.MENG H L, ZHANG W, LU B Y, HE F F, LU H J.Physiological response ofLonicera japonicaseedlings to salt stress.Jiangsu Agricultural Sciences, 2015, 43(4): 247-249. (in Chinese)

[35] 吳靈瓊, 成水平, 楊立華, 吳振斌. Cd2+和 Cu2+對(duì)美人蕉的氧化脅迫及抗性機(jī)理研究. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 26(4): 1365-1369.WU L Q, CHENG S P, YANG L H, WU Z B.Effects of Cd2+and Cu2+on oxidative stress and resistance mechanism ofCanna indica.Journal of Agricultural Environmental Science, 2007, 26(4):1365-1369. (in Chinese)

[36] SHAH K, KUMAR R G, VERMA S, DUBEY R S. Effects of cadmium on lipid peroxidation, superoxide anion generation and activities of antioxidant enzymes in growing rice seedlings.Plant Science, 2001, 161(6): 1135-1144.

[37] 杜君, 李海蘭, 李慧, 戰(zhàn)吉宬, 黃衛(wèi)東. 銅對(duì)葡萄酒釀酒酵母的氧化脅迫機(jī)制. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(2): 369-378.DU J, LI H L, LI H, ZHAN J C, HUANG W D.Oxidative stress of wine yeasts under copper exposure.Scientia Agricultura Sinica, 2011,44(2): 369-378. (in Chinese)

[38] DEVI S R, YAMMAOTO Y, MASTUMOTO H. An intracellular mechanism of aluminum tolerance associaced antioxidant status in cultured tobacco cells.Journal of Inorganic Biochemistry, 2003, 97(1):59-68.

[39] 金承濤. Al3+、高溫對(duì)釀酒酵母的脅迫作用及其耐性機(jī)制的研究[D].杭州: 浙江大學(xué), 2005.JIN C T. The effect of Al3+, high temperature stress onSaccharomycescerevisiaeand its tolerance mechanism research [D]. Hangzhou:Zhejiang University, 2005.

[40] LI J S, JIA H L, WANG J, CAO Q H, WEN Z C. Hydrogen sulfide is involved in maintaining ion homeostasis via regulating plasma membrane Na+/H+antiporter system in the hydrogen peroxide-dependent manner in saltstressArabidopsis thalianaroot.Protoplasma, 2014,251(4): 899-912.

[41] CHRISTOU A, MANGANARIS G A, PAPADOPOULOS I,FOTOPOULOS V. Hydrogen sulfide induces systemic tolerance to salinity and non-ionic osmotic stress in strawberry plants through modification of reactive species biosynthesis and transcriptional regulation of multiole defence pathways.Journal of Experimental Botany, 2013, 64: 1953-1966.

[42] SHI H T, YE T T, CHAN Z L. Exogenous application of hydrogen sulfide donor sodium hydrosulfide enhanced multiple abiotic stress tolerance in bermudagrass.Plant Physiology & Biochemistry, 2013,71(2): 226-234.

[43] 安志裝, 王校常, 嚴(yán)蔚東, 施衛(wèi)明, 曹志洪. 植物螯合肽及其在重金屬脅迫下的適應(yīng)機(jī)制. 植物生理學(xué)報(bào), 2001, 37(5): 463-467.AN Z Z, WANG X C, YAN W D, SHI W M, CAO Z H.Phytochelatins and its adaptive mechanism under heavy metal stress.Plant Physiology Communications,2001, 37(5): 463-467. (in Chinese)

[44] 李文學(xué), 陳同斌. 超富集植物吸收富集重金屬的生理和分子生物學(xué)機(jī)制. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2003, 14(4): 627-631.LI W X, CHEN T B. Physiobgical and molecular biological mechanisms of heavy metal absorption and accumulation in hyperaccumulators.Chinese Journal of Applied Ecology, 2003, 14(4):627-631. (in Chinese)

[45] 郞飛波, 張國平. 植物螯合肽及其在重金屬耐性中的作用. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2003, 14(4): 632-636.LANG F B, ZHANG G P. Phytochelatin and its function in heavy metal tolerance of higher plants.Chinese Journal of Applied Ecology,2003, 14(4): 632-636. (in Chinese).

[46] 王寧. 重金屬脅迫與生物樣品中巰基化合物的應(yīng)答作用[D]. 延吉:延邊大學(xué), 2014.WANG N. Heavy metal stress and the response of sulfhydryl compounds in biological samples [D]. Yanji: Yanbian University,2014. (in Chinese)

[47] COLEMAN J, BLAKE-KALFF M, DAVIES E. Detoxification of xenobiotics by plants: Chemical modification and vacuolar compartmentation.Trends in Plant Science, 1997, 2(4): 144-151.

[48] FREEMAN J L, PERSANS M W, NIEMAN K.Increased glutathione biosynthesis plays a role in nickel tolerance in Thlaspi nickel hyper accumulators.Plant Cell, 2004, 16(8): 2176-2191.

[49] COBBETT C, GOLDSBROUGH P. Phytochelatins and metallothioneins:Roles in heavy metal detoxification and homeostasis.Annual Review of Plant Biology, 2002, 53(1): 159.

[50] NOCTOR G, GOMEZ L, VANACKER H, FOYER C H. Interaction between biosynthesis, compartmentation and tansport in the control of gluthione homeostasis and signaling.Journal of Experimental Botany,2002, 53(372): 1283-1304.

[51] SUGIYAMA K, IZAWA S, INOUE Y. The Yap 1p- dependent induction of glutathione synthesis in heat shock response ofSaccharomyces cerevisiae.Journal of Biological Chemistry, 2000,275(20): 15535-15540.

[52] IZAWA S, INOUE Y, KIMURA A. Oxidative stress response in yeast:Effect of glutathione on adaptatin to hydrogen peroxide stress inSaccharomyces cerevisiae.FEBS Letters, 1995, 368(1): 73-76.

[53] WESTWATER J, MCLAREN N F, DORMER U H, JAMIESON D J.The adaptive response ofSaccharomyces cerevisiaeto mercury exposure.Yeast, 2002, 19(3): 233-239.

[54] SHANMUGANATHANA, AVERY SV, WILLETTS S A.Copperinduced oxidative stress inSaccharomyces cerevisiaetargets enzymes of the glycolytic pathway.FEBS Letters, 2004, 556(1-3): 253-259.

[55] SUGIYAMA K, KAWANRA A, IZAWA S, INOUE Y.Role of glutathione in heat-shock-induced cell death ofSaccharomyces cerevisiae.Biochemical Journal, 2000, 352(1): 71-78.

[56] TONGUL B, KAVAKCIOGLU B, TARHAN L. Chloramine T induced oxidative stress and the response of antioxidant system inPhanerochaete chrysosporium.Folia Microbiologica, 2017(1-2):1-9.

[57] MUKAI K, MORINCOTO H, OKAUCHI Y, NAGAOKA S. Kinetic study of reactions between tocopheroxyl radicals and fatty acids.Lipids, 1993, 28(8): 753-756.