硫代腺苷甲硫氨酸促進(jìn)番茄百菌清降解的生理機(jī)制

顧超珩，閆燕燕，魏夕雅，史慶華，鞏彪

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部黃淮海地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

0 引言

【研究意義】櫻桃番茄（Lycopersicon esculentumvar.cerasiforme）是一類具有較高營養(yǎng)價值和獨(dú)特風(fēng)味的鮮食番茄。其產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益高，栽培面積大，在我國發(fā)展迅速，甚至已經(jīng)成為一些地區(qū)的農(nóng)業(yè)支撐產(chǎn)業(yè)。但設(shè)施栽培條件下，櫻桃番茄易受各種病原菌侵染，引起葉霉病、灰霉病、早疫病、晚疫病和炭疽病等病害。作為生產(chǎn)中廣泛使用的廣譜性殺菌劑，百菌清（2,4,5,6-tetrachloroisophthalonitrile，chlorothalonil，CHT）常被應(yīng)用于上述病害的化學(xué)防控，其用藥安全期為 25 d[1]。但櫻桃番茄生產(chǎn)多連續(xù)采摘，一旦用藥，將會導(dǎo)致后續(xù)產(chǎn)品農(nóng)殘超標(biāo)，影響經(jīng)濟(jì)效益和人類健康。因此，研究番茄快速代謝農(nóng)藥的技術(shù)及機(jī)制，對鮮食番茄安全生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】對于植物而言，農(nóng)藥是一類異源有毒物質(zhì)，施用過多會對植物造成毒害，引起生理、生化代謝異常，導(dǎo)致植株生長、發(fā)育受阻，產(chǎn)量、品質(zhì)下降[2]。而植物在長期進(jìn)化中形成了一套獨(dú)特的解毒系統(tǒng)，能夠轉(zhuǎn)化、分解對其生長和發(fā)育不利的異源化學(xué)物質(zhì)；其解毒過程分為4個階段，也稱為4項代謝[3]：包括（I）細(xì)胞色素P450s和過氧化物酶體的氧化作用；（II）谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（GST）催化的谷胱甘肽共價結(jié)合反應(yīng)；（III）ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的有毒物質(zhì)區(qū)域化隔離；（IV）水解酶參與的降解反應(yīng)。4項代謝中，前兩項代謝負(fù)責(zé)將有毒的大分子集團(tuán)破壞，形成毒性低、移動性差的水溶性代謝產(chǎn)物；后兩項代謝負(fù)責(zé)將低毒小分子物質(zhì)區(qū)域化并進(jìn)一步水解[4]。由此可見，催化氧化反應(yīng)和谷胱甘肽螯合反應(yīng)是植物進(jìn)行農(nóng)藥代謝的關(guān)鍵步驟。前人研究表明，外源添加油菜素內(nèi)酯[2]、一氧化氮[5]、胡敏酸[6]等均可促進(jìn)植物農(nóng)藥代謝。筆者研究發(fā)現(xiàn)，硫代腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthetase，SAMS）是控制硫代腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）合成的關(guān)鍵酶，可對多種非生物脅迫產(chǎn)生響應(yīng)[7]；且對鹽堿脅迫下番茄的活性氧（ROS）和谷胱甘肽代謝具有顯著的調(diào)控作用[8-9]。此外，SAM自1975年開始在歐洲作為抗憂郁和關(guān)節(jié)炎的處方藥投入使用；1999年，SAM首度以膳食補(bǔ)充劑的身份在美國推廣和發(fā)售[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】推測 SAM可能參與調(diào)控包含農(nóng)藥在內(nèi)的異源有毒物質(zhì)降解，但至今該研究領(lǐng)域尚屬空白。【擬解決的關(guān)鍵問題】擬通過研究外源 SAM對植物谷胱甘肽解毒途徑的影響，闡明SAM對番茄CHT代謝的作用效果及機(jī)理，探討一種可用于鮮食櫻桃番茄農(nóng)藥降解的簡便方法，為蔬菜安全、綠色生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年3—10月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)設(shè)計

供試番茄品種為櫻桃番茄‘千禧’。采用常規(guī)育苗和栽培技術(shù)管理，待果實(shí)綠熟期時向果實(shí)表面按推薦劑量噴施CHT（75%可濕性粉劑，先正達(dá)生物科技有限公司）。2 d后，采用小型噴霧器將清水（Control）、0.1、0.5、1 和 2 μmol·L-1的 SAM 溶液均勻噴施于用藥番茄的表面，以剛能完全打濕果實(shí)表面作為處理標(biāo)準(zhǔn)，于農(nóng)藥處理后2、5、10和15 d取番茄果實(shí)，測定CHT含量，以確定SAM的合理用量。ROS與谷胱甘肽代謝分析采用上述試驗(yàn)材料與培養(yǎng)方法，設(shè)置對照（Control）、單獨(dú)施用CHT處理（CHT）和施用 CHT 并噴施 0.5 μmol·L-1的 SAM 處理（CHT+SAM）共計 3個處理，于農(nóng)藥處理后 2、5、10和15 d后取番茄果實(shí)，對ROS及谷胱甘肽代謝相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測定。

1.2 測定方法

1.2.1 百菌清含量 取番茄果實(shí)樣品10 g，利用高速分散器磨碎，以80 mL 80℃的石油醚與40 g無水硫酸鈉浸提過夜，濾液經(jīng)真空抽濾后，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)，以正己烷溶解，定容至5 mL，提取液經(jīng)固相萃取柱凈化吸附，收集洗脫液用于色譜分析。氣相色譜檢測條件為：GC-ECD（Agilent Santa Clara, CA, USA）；色譜柱：30 m×0.32 mm，0.25 μm；載氣：氮?dú)猓涣魉伲?.3 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度：250℃；檢測器溫度：300℃；柱溫：以25℃·min-1的速度由80℃升至260℃，最終保持3.8 min[5]。

1.2.2 ROS和丙二醛（MDA）含量 采用磺胺比色法測定超氧陰離子（）含量[11]；四氯化鈦還原法測定過氧化氫（H2O2）含量[12]；硫代巴比妥酸法測定MDA含量[13]。

1.2.3 谷胱甘肽代謝酶活性 谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性的測定參照李順欣等[14]的方法；谷胱甘肽還原酶（GR）活性的測定參照 FOYER和HALLIWELL[15]的方法；脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性的測定參照 NAKANO和 ASADA[16]的方法。

1.2.4 谷胱甘肽含量 采用GONG等[17]的方法測定還原型谷胱甘肽（GSH）含量和總谷胱甘肽（GSH+GSSG）含量，計算氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量和谷胱甘肽還原氧化比（GSH/GSSG）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)處理及指標(biāo)測定均執(zhí)行3次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007和SAS8.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，采用最小差異差數(shù)法（LSD）進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

圖1 不同濃度SAM對番茄果實(shí)CHT含量的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of SAM on CHT contents of tomato fruits

2 結(jié)果

2.1 SAM對CHT的降解效果

圖1表明，果實(shí)表面噴施CHT后會產(chǎn)生CHT積累，且隨著時間的延長，CHT可被番茄果實(shí)自行降解，處理后15 d下降至噴藥2 d時的30.71%（P＜0.05）。與對照相比，外源噴施 0.1 μmol·L-1的 SAM 在 2—10 d內(nèi)雖能降低番茄果實(shí)CHT含量，但差異不顯著（P＜0.05）；至 15 d 時，0.1 μmol·L-1SAM 處理組的 CHT含量才顯著低于對照（P＜0.05）。與對照相比，外源噴施0.5、1和 2 μmol·L-1的SAM 均可在5 d時顯著降低番茄果實(shí)CHT含量，其降低效果持續(xù)至15 d；但0.5、1和2 μmol·L-1SAM處理組之間的CHT含量差異不顯著（P＜0.05）。因此，0.5 μmol·L-1的 SAM 可作為番茄 CHT降解的有效處理組用于后續(xù)試驗(yàn)，其CHT殘留量在處理后5、10和15 d較同時期對照組分別下降了33.72%、52.87 %和63.75 %。

2.2 SAM對ROS代謝的影響

圖 2 CHT 和 CHT+SAM 對番茄果實(shí) O2?-、H2O2和 MDA 含量的影響Fig. 2 Effects of CHT and CHT+SAM on contents of, H2O2 and MDA of tomato fruits

鑒于 ROS在參與植物降解農(nóng)藥的氧化過程中發(fā)揮重要作用，本研究先就SAM和CHT對ROS含量的影響進(jìn)行分析（圖2）。結(jié)果表明，番茄果實(shí)的含量于噴施CHT 2 d時顯著高于對照，其余處理時段與對照差異不顯著（P＜0.05）；H2O2含量于噴施CHT 2 d和5 d時顯著高于對照，其余處理時段與對照差異不顯著（P＜0.05）；而MDA含量在噴施CHT的各處理時段下均與對照差異不顯著（P＜0.05）。說明噴施CHT可在短期內(nèi)引起番茄的氧化應(yīng)激反應(yīng)，但這種氧化應(yīng)激并不足以造成細(xì)胞損傷。而 CHT+SAM處理下第5天的和 H2O2含量顯著高于 CHT處理；CHT+SAM處理下第10天的和 H2O2含量略高于CHT處理，但顯著高于對照（P＜0.05）。不同時期各處理組間的 MDA含量差異不顯著（P＜0.05）。說明CHT+SAM處理在沒有造成氧化傷害的情況下，較 CHT處理更強(qiáng)烈且更持久的引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。

2.3 SAM對谷胱甘肽代謝的影響

谷胱甘肽循環(huán)是植物應(yīng)對脅迫和解毒的關(guān)鍵代謝途徑，主要涉及GSH和GSSG之間的轉(zhuǎn)換與利用，而GR和DHAR則是控制GSSG再生成GSH的關(guān)鍵酶。與對照相比，CHT處理可在各時期內(nèi)增強(qiáng)GR與DHAR的活性；CHT處理下的GR和DHAR活性與對照間的差距均呈現(xiàn)先增后減的趨勢，于處理后 5 d達(dá)到最大（圖3）。說明CHT處理可激活GR和DHAR，提高谷胱甘肽循環(huán)效率。CHT+SAM處理下第5天和第10天的GR和DHAR活性顯著高于CHT處理，而第15天的GR和DHAR活性顯著低于CHT處理（P＜0.05）；但各時期內(nèi)CHT+SAM處理下的GR和DHAR活性均顯著高于對照（P＜0.05）（圖3）。說明CHT+SAM處理較CHT處理能更有效的在農(nóng)藥降解早期激活GR和DHAR活性。

圖4顯示，GSH含量在CHT處理2—10 d時顯著高于對照，至15 d時與對照差異不顯著（P＜0.05）；而CHT+SAM處理5—15 d時的GSH含量顯著高于對照及 CHT處理（P＜0.05）。GSSG含量在 CHT處理2—10 d時顯著高于對照，至15 d時與對照差異不顯著（P＜0.05）；但 CHT+SAM 處理 2—5 d時的 GSSG含量與 CHT處理差異不顯著，至處理10—15 d時顯著低于 CHT處理（P＜0.05）。GSH+GSSG在CHT處理2—10 d時顯著高于對照，至 15 d時與對照差異不顯著（P＜0.05）；而CHT+SAM處理5 d時的GSH+GSSG顯著高于CHT處理，其余處理時段與 CHT處理差異不顯著（P＜0.05）。GSH/GSSG在CHT處理2—5 d時顯著高于對照，至10—15 d時顯著低于對照（P＜0.05）；但CHT+SAM處理5—15 d時的GSH/GSSG均顯著高于對照及CHT處理（P＜0.05）。說明CHT處理能促進(jìn)谷胱甘肽的從頭合成，提高GSH的還原效率，而SAM主要從提高GSH還原效率層面調(diào)控谷胱甘肽代謝以適應(yīng)番茄的農(nóng)藥降解需求。

圖3 CHT和CHT+SAM對番茄果實(shí)GR和DHAR活性的影響Fig. 3 Effects of CHT and CHT+SAM on activities of GR and DHAR of tomato fruits

圖4 CHT和CHT+SAM對番茄果實(shí)GSH、GSSG、GSH+GSSG和GSH/GSSG的影響Fig. 4 Effects of CHT and CHT+SAM on contents of GSH, GSSG, GSH+GSSG and GSH/GSSG of tomato fruits

2.4 SAM對農(nóng)藥降解關(guān)鍵酶GST活性的影響

GST是生物體針對各類有毒物質(zhì)進(jìn)行解毒的關(guān)鍵酶。圖5顯示，GST活性在CHT處理2—10 d時顯著高于對照（P＜0.05），至15 d時略高于對照，其在處理后第5天達(dá)到峰值。說明GST是CHT代謝響應(yīng)的關(guān)鍵酶之一。而CHT+SAM處理5—10 d時的GST活性顯著高于CHT處理（P＜0.05），但CHT+SAM處理 15 d時的 GST活性顯著低于 CHT處理（P＜0.05），略低于對照。說明CHT+SAM處理較CHT處理能更有效的在農(nóng)藥降解早期激活GST活性。

3 討論

SAM是蛋氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，其在動物、植物和微生物中的代謝通路相對保守。除了參與蛋氨酸循環(huán)外，SAM還參與了轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)氨丙基、轉(zhuǎn)硫等多種生理作用，從而影響谷胱甘肽、煙酰胺、多胺和乙烯等多類信號物質(zhì)的代謝反應(yīng)[18]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，SAMS1可受多種逆境誘導(dǎo)，促進(jìn)SAM合成，以幫助植物應(yīng)對受脅迫造成的傷害[7-8,19]。本研究表明，外源添加0.5 μmol·L-1的SAM即可顯著激活番茄的谷胱甘肽解毒系統(tǒng)，促進(jìn)農(nóng)藥降解。說明 SAM 并非作為能量代謝物質(zhì)，而是通過擔(dān)當(dāng)信號分子調(diào)控番茄的農(nóng)藥解毒過程。

圖5 CHT和CHT+SAM對番茄果實(shí)GST活性的影響Fig. 5 Effects of CHT and CHT+SAM on GST activity of tomato fruits

植物進(jìn)行農(nóng)藥代謝的第一步反應(yīng)是借助細(xì)胞內(nèi)的氧化力對農(nóng)藥分子中不穩(wěn)定的化學(xué)鍵進(jìn)行氧化修飾，其主要涉及細(xì)胞色素 P450s。作為植物最大的基因家族，目前已有5 100多個細(xì)胞色素P450s基因被注釋[20]。ZHOU等[2]借助轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在番茄中鑒定到2個受CHT誘導(dǎo)的細(xì)胞色素基因P450（基因ID：AI776109和 BF112381），但更為深入的遺傳驗(yàn)證工作尚未開展。由于細(xì)胞色素P450s基因家族過于龐大，科學(xué)家至今未能確定植物農(nóng)藥代謝過程中的關(guān)鍵細(xì)胞色素基因P450s。但細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的氧化修飾過程需要細(xì)胞內(nèi)有足夠的氧化性物質(zhì)來提供氧化力，故本研究分析了CHT與CHT+SAM對和H2O2的含量的影響。發(fā)現(xiàn)外源添加0.5 μmol·L-1的SAM可在沒有造成細(xì)胞氧化傷害的情況下引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)（圖2）。SAM是生物體內(nèi)多胺和乙烯的共同合成前體[18]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)SAMS1[8]或外源添加SAM[9]均可誘導(dǎo)番茄內(nèi)源多胺和乙烯含量的增加。多胺的積累會激活多胺氧化酶活性，促進(jìn)多胺降解，釋放出反應(yīng)副產(chǎn)物—H2O2[9]；另外，乙烯信號代謝通路往往也涉及 ROS爆發(fā)[21]，這可能是本研究中外源SAM能進(jìn)一步誘導(dǎo)ROS的主要原因。綜上所述，在對照處理下，番茄細(xì)胞的 ROS產(chǎn)生和消除處于平衡態(tài)；CHT造成的輕度脅迫可引起ROS產(chǎn)量增加，激活植物的系統(tǒng)性防御反應(yīng)[22]，協(xié)同細(xì)胞色素 P450促進(jìn)CHT的氧化降解；外源添加SAM可能從多胺和乙烯代謝通路上協(xié)同增強(qiáng)ROS信號介導(dǎo)的防御反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)CHT的氧化降解。但無論是CHT處理還是CHT+SAM處理，其細(xì)胞內(nèi)的ROS積累均未超越抗氧化系統(tǒng)的清除能力，故本研究中MDA含量在不同處理間并未產(chǎn)生顯著差異。但隨著處理時間的延長，、H2O2和MDA含量均呈現(xiàn)上升趨勢，這可能是由于番茄在成熟過程中呼吸速率增加，造成的ROS積累和細(xì)胞膜系統(tǒng)降解所致。

SAM經(jīng)過轉(zhuǎn)甲基、水解和轉(zhuǎn)硫作用生成半胱氨酸（Cys），Cys在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的催化下經(jīng)γ-谷氨酰半胱氨酸生成 GSH[18]。這可能是本研究中CHT+SAM 處理的 GSH含量和谷胱甘肽總量均高于CHT處理的原因之一。另外，在番茄[8-9]和苜蓿[23]中超表達(dá)SAMS1均能通過激活GR和DHAR活性，促進(jìn)GSSG向GSH轉(zhuǎn)換，增加谷胱甘肽還原氧化比。這與本研究中外源 SAM 對谷胱甘肽代謝的影響相吻合。在植物中，GSH一方面能夠減少由于環(huán)境和代謝產(chǎn)物脅迫而引發(fā)的ROS積累，消除ROS對植物機(jī)體的傷害作用；另一方面，GSH又能夠在GST的催化作用下與異源有毒物質(zhì)結(jié)合，促進(jìn)有害物質(zhì)的區(qū)域化降解[24-25]。本研究中GSH含量與和H2O2含量的變化趨勢相一致，說明SAM通過誘導(dǎo)ROS積累，激活了GSH的從頭合成和再生，增加了谷胱甘肽還原氧化比，使得更多的GSH可以用于GST介導(dǎo)的農(nóng)藥代謝過程。此外，大量研究表明，多胺[26-28]和乙烯[29-30]信號對谷胱甘肽代謝也存在顯著的激活作用，這可能是外源SAM促進(jìn)谷胱甘肽代謝的間接調(diào)控途徑。

4 結(jié)論

硫代腺苷甲硫氨酸作為一種對人類和環(huán)境無害的天然生物代謝物質(zhì)，可通過激活活性氧和谷胱甘肽代謝途徑，促進(jìn)番茄對百菌清的降解?；赗OS和谷胱甘肽在植物解毒途徑中功能的保守性，推測硫代腺苷甲硫氨酸可延伸應(yīng)用于其他作物中的農(nóng)藥代謝降解，但其相關(guān)研究仍需后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。研究結(jié)果為硫代腺苷甲硫氨酸在蔬菜綠色生產(chǎn)和農(nóng)藥化控降解技術(shù)應(yīng)用的研究領(lǐng)域奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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