白藜蘆醇對阿霉素誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的保護作用及機制研究

阿霉素是一種廣泛應(yīng)用于治療實體腫瘤和血液系統(tǒng)腫瘤的細胞毒藥物，該藥物的心臟毒性限制了其應(yīng)用[1]。研究表明，阿霉素的心臟毒性與化療周期中阿霉素的總累積劑量相關(guān)，長期高劑量使用可導(dǎo)致嚴(yán)重且不可逆的退行性心肌病和充血性心力衰竭[2-4]。阿霉素引起心臟不良反應(yīng)的機制尚未完全明確，可能涉及多種途徑，包括氧自由基生成、過氧亞硝酸鹽形成、鈣超載、線粒體功能障礙、細胞凋亡及自噬等[5-6]。

E2F轉(zhuǎn)錄因子1(E2F1)通過影響細胞周期，在癌癥進展中發(fā)揮重要作用[7]。研究表明，E2F1調(diào)節(jié)腺苷酸活化蛋白激酶α2(AMPKα2)，參與阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性[8-9]。白藜蘆醇(RSV)是一種天然的植物抗毒素，可以通過減少氧化應(yīng)激、抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)自噬過程，部分逆轉(zhuǎn)阿霉素的心臟毒性[11-13]。本研究擬通過建立細胞模型，探討RSV對阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的調(diào)控作用，以及E2F1/AMPKα2信號通路在其中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

大鼠心肌細胞系(H9c2)購自美國組織培養(yǎng)中心(ATCC)，采用含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。用無血清培養(yǎng)基沖洗細胞后，將細胞予以不同時間梯度的1 μmol/L阿霉素處理。細胞處理后，取96孔板，每孔加入細胞懸液100 μL，細胞濃度為2×105個/mL，加入5 g/L MTT溶液20 μL，于37 ℃反應(yīng)4 h。加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處的吸光度值。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染

待H9c2細胞生長至70%融合度時，根據(jù)Lipofectamine Plus(Invitrogen公司)說明書，采用終濃度為40 nmol/L的E2F1的小干擾RNA siE2F1轉(zhuǎn)染H9c2細胞(siE2F1轉(zhuǎn)染組)，靶序列為5′-CCUGGAGCAUGUUAAAGAAUU-3′。siRNA陰性對照組轉(zhuǎn)染終濃度為40 nmol/L的siRNA陰性對照，空白對照組加入等量生理鹽水培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染6 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞檢測E2F1的表達水平。實時聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測E2F1轉(zhuǎn)染效率，Trizol法提取細胞總RNA，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。擴增條件：95 ℃，10 min解鏈；隨后95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。內(nèi)參GAPDH引物序列：上游引物5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，下游引物5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′。E2F1引物序列：上游引物5′-GCAACGCCGCAGGCG CCC-3′，下游引物5′-GAGTTGGATGCCCTCCA GG-3′。采用 2-ΔΔCt法計算E2F1 mRNA的相對表達量。

1.3 實驗分組

將H9c2細胞分為6組：對照組、阿霉素組、 siE2F1組、阿霉素+siE2F1組、RSV組、阿霉素+RSV組。阿霉素組加入終濃度為1 μmol/L的阿霉素，siE2F1組在siE2F1轉(zhuǎn)染細胞中加入等量的生理鹽水，阿霉素+siE2F1組為siE2F1轉(zhuǎn)染細胞，加入終濃度為1 μmol/L的阿霉素，RSV組加入終濃度為20 μmol/L的RSV，阿霉素+RSV組同時加入終濃度為1 μmol/L的阿霉素和20 μmol/L的RSV，對照組加入等量的生理鹽水，干預(yù)24 h后收獲細胞。

1.4 細胞凋亡檢測

按照凋亡檢測試劑盒(BD Pharmingen公司)使用說明書，采用Annexin V-FITC和PI各5 μL對細胞進行雙染色。室溫避光孵育15 min后，流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達水平

采用RIPA細胞裂解液提取細胞蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對蛋白(20 μg)進行分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h，E2F1兔多克隆抗體(1∶1 000，Sigma-Aldrich公司)、AMPKα2兔單克隆抗體(1∶1 000，Sigma-Aldrich公司)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)兔多克隆抗體(1∶1 000，Cell Signaling Technology公司)、GAPDH兔多克隆抗體(1∶1 000，Sigma-Aldrich公司)4 ℃孵育過夜，山羊抗兔二抗(1∶5 000)常溫孵育1 h。滴加ECL化學(xué)發(fā)光劑，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-rad公司)顯影，并用ImageJ軟件對條帶灰度值進行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩個獨立樣本間比較用t檢驗，多個獨立樣本間比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿霉素降低心肌細胞活力

阿霉素?fù)p傷可顯著降低心肌細胞活力，并呈時間依賴性(阿霉素不同處理時間與0 h相比，P均<0.05)，當(dāng)處理時間為24 h時，細胞活力下降約50%，損傷程度適宜，以該濃度進行后續(xù)實驗。

2.2 siE2F1轉(zhuǎn)染抑制E2F1表達

轉(zhuǎn)染48 h后，siE2F1轉(zhuǎn)染組E2F1 mRNA和蛋白的表達水平與siRNA 陰性對照組和空白對照組相比均顯著降低(P均<0.001)，見表1。

表1 轉(zhuǎn)染后各組E2F1 mRNA和蛋白表達水平比較

2.3 阿霉素通過上調(diào)E2F1誘導(dǎo)心肌細胞凋亡

采用Annexin V/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，與對照組相比，阿霉素組H9c2心肌細胞凋亡率顯著升高，siE2F1組凋亡率顯著降低，阿霉素+siE2F1組凋亡率顯著升高(P均<0.05)。與阿霉素組相比，阿霉素+siE2F1組凋亡率顯著降低(P<0.001)。見圖1A、表2。

采用Western blot法檢測細胞內(nèi)蛋白水平，與對照組相比，阿霉素組E2F1、AMPKα2和caspase-3剪切體(cleaved caspase-3)的蛋白表達水平顯著升高(P均<0.001)；siE2F1組E2F1、AMPKα2的蛋白表達水平顯著降低(P均<0.001)，cleaved caspase-3的蛋白表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異；阿霉素+siE2F1組E2F1、AMPKα2的蛋白表達水平顯著降低，cleaved caspase-3的蛋白表達水平顯著升高(P均<0.001)。但與阿霉素組相比，阿霉素+siE2F1組E2F1、AMPKα2和cleaved caspase-3的蛋白表達水平均顯著降低(P均<0.001)。見圖1B、表2。

2.3 RSV通過抑制E2F1部分逆轉(zhuǎn)阿霉素介導(dǎo)的心肌細胞凋亡

Annexin V/PI雙染流式細胞術(shù)檢測顯示，RSV組細胞凋亡率與對照組、阿霉素組相比顯著降低(P均<0.05)；阿霉素+RSV組細胞凋亡率雖高于對照組，但顯著低于阿霉素組(P均<0.001)。見圖2A、表3。

注：A為Annexin V/PI雙染色法檢測各組心肌細胞凋亡水平；B為Western blot法檢測各組心肌細胞蛋白表達情況

表2 siE2F1轉(zhuǎn)染后各組H9c2心肌細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達水平的比較

RSV組E2F1、AMPKα2和cleaved caspase-3的蛋白表達水平與對照組、阿霉素組相比顯著降低(P均<0.05)。阿霉素+RSV組E2F1、AMPKα2和cleaved caspase-3的蛋白表達水平雖高于對照組，但與阿霉素組相比顯著降低(P均<0.001)。見圖2B、表3。

注：A為Annexin V/PI雙染色法檢測各組心肌細胞凋亡水平；B為Western blot法檢測各組心肌細胞蛋白表達情況

表3 RSV干預(yù)后各組H9c2心肌細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達水平的比較

3 討論

阿霉素屬蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，廣泛應(yīng)用于實體腫瘤和血液系統(tǒng)腫瘤的治療[14]。阿霉素在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時，可對正常細胞產(chǎn)生毒性，由于其容易在心肌細胞中積累，故有明顯的心臟毒性[2-4,15]。本研究結(jié)果提示阿霉素能夠降低心肌細胞的活力，促使心肌細胞發(fā)生凋亡。

我們既往的研究證明阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性與p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)/p53和AMPK/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/自噬相關(guān)蛋白1(Ulk1)的信號通路有關(guān)[11-12,16]。但有關(guān)阿霉素對AMPK活化作用的研究得出了不同結(jié)論[9,17-19]。AMPK可能有具有雙重作用的亞型，即具有維持細胞存活特性的亞型(AMPKα1)和誘導(dǎo)細胞凋亡的亞型(AMPKα2)[9]。另外，E2F1可通過轉(zhuǎn)錄激活G1/S轉(zhuǎn)換和調(diào)節(jié)有絲分裂的相關(guān)基因，使細胞進行不可逆的DNA復(fù)制，在癌癥進展中發(fā)揮重要作用[7]。隨后的研究表明，與增殖和惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的其他生物過程也受E2F1調(diào)節(jié)，包括細胞生長、自噬、侵襲和轉(zhuǎn)移[20-21]。E2F1還可通過激活A(yù)MPKα2，參與阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性過程[9]。本研究結(jié)果顯示，在H9c2心肌細胞中，阿霉素可誘導(dǎo)E2F1和AMPKα2的激活，抑制E2F1可減輕阿霉素誘導(dǎo)的AMPKα2的激活和細胞凋亡過程。

RSV是一種在葡萄中大量存在的多酚化合物，具有抗氧化、抗炎和抗癌特性[10]。RSV的心臟保護作用與減少氧化應(yīng)激、抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)自噬等相關(guān)[11-12]。研究表明，RSV可減少過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激，從而在糖尿病心肌病大鼠模型中發(fā)揮心臟保護作用[13,22]。RSV還可通過抑制Bax和caspase-3的活化，抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡[23-25]。既往的研究表明，RSV與阿霉素聯(lián)合使用可以預(yù)防阿霉素的心臟毒性，并在體內(nèi)和體外協(xié)同抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[11-12,16]。RSV能夠通過下調(diào)E2F1和抑制磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸激酶(p-AKT)，增加鼻咽癌(NPC)細胞對放射的敏感性，促進NPC凋亡[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，RSV可部分逆轉(zhuǎn)阿霉素引起的H9c2心肌細胞凋亡，抑制E2F1和AMPKα2的激活，提示RSV對阿霉素所致心肌細胞凋亡的保護作用可能是通過調(diào)控E2F1/AMPKα2信號通路實現(xiàn)的。