去鐵胺預(yù)處理聯(lián)合七氟醚后處理對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

糖尿病是心血管疾病的重要危險因素，合并糖尿病的缺血性心臟病患者圍術(shù)期發(fā)生心肌缺血再灌注(I/R)損傷的比例是非糖尿病缺血性心臟病患者的2～3倍[1]，有效降低圍術(shù)期糖尿病患者I/R損傷極為重要。七氟醚是一種廣泛應(yīng)用于臨床和基礎(chǔ)實驗的吸入麻醉劑。七氟醚后處理(SPostC)可以發(fā)揮與缺血預(yù)處理類似的心肌保護(hù)作用，并且對年輕和健康心肌發(fā)生的I/R損傷具有良好的保護(hù)效果[2-3]。在糖尿病狀態(tài)下，SPostC的保護(hù)作用弱化[4]，但具體機制尚未明確。我們前期研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)在SPostC減輕健康心肌 I/R 損傷中發(fā)揮重要作用[5]。在糖尿病狀態(tài)下，HIF-1α受損[6-7]，HIF-1α可能是導(dǎo)致SPostC心肌保護(hù)作用弱化的關(guān)鍵。本文旨在觀察去鐵胺預(yù)處理聯(lián)合SPostC對糖尿病大鼠心肌I/R損傷的影響，探討通過激活糖尿病狀態(tài)下受損的HIF-1α恢復(fù)SPostC的心肌保護(hù)作用的機制。

1 材料與方法

1.1 離體心臟模型的制備

常州卡文斯實驗動物有限公司提供清潔級健康雄性糖尿病GK大鼠75只，體質(zhì)量300～350 g，周齡為14～16周，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2016-0010。參照參考文獻(xiàn)[5]建立Langendorff模型：大鼠腹腔注射250 U/kg肝素抗凝和40 mg/kg 1%戊巴比妥鈉麻醉后，固定在鼠板。迅速開胸暴露心臟及心底部大血管，剪下心臟，保留合適長度的主動脈(3～4 mm)，立即放入預(yù)冷的4 ℃ K-H液(NaCl 118 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L、KH2PO31.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、葡萄糖11 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L，pH值7.45)中使心腔的血液排空。用眼科鑷夾住主動脈兩側(cè)，4號手術(shù)線將心臟固定于灌注針上，用95%O2、5%CO2預(yù)先平衡過的37 ℃ K-H液行主動脈逆行灌注，剪開肺動脈及左心耳，通過二尖瓣口將自制橡膠球囊沿左心耳插入左心室，并連接Powerlab/8SP生物功能實驗壓力傳感器系統(tǒng)。維持60～70 mmHg的灌注壓，調(diào)整氣囊大小和位置，并將左室舒張末期壓力(LVEDP)維持在0～10 mmHg。上述步驟應(yīng)在2 min內(nèi)完成。離體心臟平衡20 min后，如心率>250次/min，左室發(fā)展壓(LVDP)>80 mmHg、室性早搏<2次/min，則提示建模成功。

1.2 實驗分組

將75只糖尿病大鼠隨機分為5組(n=15)。對照組心臟持續(xù)灌注K-H液180 min。缺血再灌注組(I/R組)心臟平衡20 min后，灌注4 ℃ Thomas心臟停搏液使心臟停跳，32 ℃下心臟停跳40 min后(無灌注K-H液)，復(fù)溫至37 ℃后再灌注K-H液復(fù)跳120 min。SPostC組心臟平衡20 min后，灌注4 ℃ Thomas心臟停搏液使心臟停跳，32 ℃下缺血40 min后，再灌注2.4%七氟醚(日本丸石制藥株式會社)飽和的K-H液15 min，后續(xù)灌正常K-H液105 min。去鐵胺預(yù)處理組(DFO組)心臟缺血前24 h大鼠腹腔給予200 mg/kg去鐵胺(瑞士諾華制藥有限公司)，其余同I/R組。去鐵胺預(yù)處理+SPostC組(DFO+SPostC組)心臟缺血前24 h大鼠腹腔給予200 mg/kg去鐵胺，其余同SPostC組。

1.3 血流動力學(xué)指標(biāo)檢測

各組再灌注結(jié)束時，通過Powerlab/8SP數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)記錄心率、LVDP、LVEDP以及左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)等指標(biāo)。

1.4 透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)

再灌注2 h后，從每組中隨機取4個心臟，每個心臟取1 mm×1 mm×1 mm左室心肌，經(jīng)過固定、沖洗、脫水、包埋、切片、染色后，H-600型透射電鏡(×10 000，日本Hitachi公司)觀察心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.5 TTC染色法測定心肌梗死面積

再灌注2 h后，從每組中隨機取5個心臟，置于-80℃冰箱中冷凍7 min，將整個心臟從心尖到心臟底部進(jìn)行切片，切成厚度大致相同的5片。將心臟切片置于37 ℃、1% TTC溶液中染色20 min，10%福爾馬林固定24 h后進(jìn)行數(shù)碼照相。心肌梗死面積采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算。

1.6 Western blot分析

再灌注2 h后，從每組中隨機取6個心臟，通過組織裂解液提取心肌組織總蛋白。取蛋白樣品30 μg，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，轉(zhuǎn)膜，于37 ℃封閉2 h，分別加入小鼠抗大鼠HIF-1α單克隆抗體(1∶1 000，美國Sigma公司)、小鼠抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)單克隆抗體(1∶1 000，美國Sigma公司)和山羊抗鼠GAPDH多克隆抗體(1∶1 000，美國Sigma公司)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗兔抗鼠IgG-HRP和兔抗山羊IgG-HRP(美國Sigma公司)室溫孵育1 h。ECL顯色成像，應(yīng)用Quantity One圖像分析系統(tǒng)對目的蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析，Newman-Keuls法進(jìn)行顯著性檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血流動力學(xué)指標(biāo)比較

與對照組相比，I/R組、SPostC組、DFO組、DFO+SPostC組心率、LVDP、+dp/dtmax均明顯降低，LVEDP明顯增加(P均<0.05)；與I/R組相比，DFO組、DFO+SPostC組LVEDP明顯降低，且心率、LVDP、+dp/dtmax明顯改善(P均<0.05)；與DFO組相比，DFO+SPostC組LVEDP明顯降低，且心率、LVDP、+dp/dtmax明顯改善(P均<0.05)。見表1。

表1 各組血流動力學(xué)指標(biāo)比較

2.2 心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)比較

電鏡下觀察，對照組線粒體結(jié)構(gòu)完整，排列整齊；I/R組肌絲溶解甚至斷裂，線粒體腫脹，嵴膜間隙變寬、破裂，肌漿網(wǎng)高度擴張；SPostC組線粒體與I/R組無明顯區(qū)別；DFO組線粒體結(jié)構(gòu)完整度略優(yōu)于I/R組，但線粒體仍顯腫脹，排列紊亂，肌絲部分溶解；DFO+SPostC組較DFO組明顯改善，線粒體形態(tài)基本完整，排列整齊，但仍略有腫脹。見圖1。

2.3 心肌梗死面積比較

與對照組相比，SPostC組梗死面積明顯增加[(37.2±3.77)%對(2.84±0.93)%，P<0.05]。與I/R組[(38.8±2.28)%]相比，DFO組[(29.2±3.11)%]和DFO+SPostC組[(21.4±4.16)%]的梗死面積均明顯減少(P均<0.05)；DFO+SPostC組與DFO組相比，心肌梗死面積明顯減少(P<0.05)。見圖2。

圖2 TTC染色檢測各組心肌梗死情況

2.4 HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平比較

與對照組相比，SPostC組HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平均明顯增加(P均<0.05)；與I/R組相比，DFO組、DFO+SPostC組HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平均明顯增加(P均<0.05)；DFO+SPostC組HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平與較DFO組明顯增加(P<0.05)，見圖3、表2。

圖3 Western blot法檢測各組HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)情況

表 2 各組HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

本研究中，Langendofff體外灌注模型消除了體液和神經(jīng)因素的影響，有助于觀察藥物對心臟的直接影響。本研究結(jié)果表明，遭受I/R損傷后，糖尿病大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)明顯受損，提示離體心臟I/R損傷模型制備成功。SPostC組各指標(biāo)與I/R組并無明顯差異，這與Drenger的研究結(jié)論一致[4]，說明糖尿病心肌發(fā)生 I/R 損傷時的心肌保護(hù)作用被弱化。

研究表明，在低氧條件下，HIF-1α是通過調(diào)控VEGF、促紅細(xì)胞生成素(EPO)等下游靶基因的表達(dá)促使細(xì)胞生存的關(guān)鍵因子[8]，也是觸發(fā)心肌內(nèi)源性保護(hù)機制的樞紐。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α是介導(dǎo)SPostC對抗缺血心肌損傷的內(nèi)源性關(guān)鍵靶點。為了證實在糖尿病狀態(tài)下，這一靶點受損可能是導(dǎo)致SPostC保護(hù)作用弱化的根源，本研究觀察去鐵胺預(yù)處理聯(lián)合SPostC對糖尿病大鼠心肌I/R損傷的影響，發(fā)現(xiàn)DFO組心功能明顯改善，心肌超微結(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于I/R組，心肌梗死面積也明顯減少，而DFO+SPostC組各指標(biāo)優(yōu)于DFO組，提示去鐵胺具有減輕糖尿病大鼠心肌I/R損傷的作用，并且能夠恢復(fù)糖尿病狀態(tài)下SPostC的心肌保護(hù)作用。

去鐵胺是美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的一種高選擇性鐵螯合劑，臨床使用已近半個世紀(jì)。去鐵胺不僅能阻斷芬頓反應(yīng)，還能抑制脯氨酰羥化酶，從而激活某些缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，使細(xì)胞適應(yīng)缺氧的環(huán)境。研究表明，無論全身還是局部應(yīng)用去鐵胺都能穩(wěn)定并激活HIF-1α，上調(diào)其下游靶基因，促進(jìn)糖尿病患者傷口的愈合[9]。本研究結(jié)果表明，I/R組HIF-1α表達(dá)并沒有增加，這與Marfella等[10]的研究結(jié)論一致，說明在糖尿病狀態(tài)下HIF-1α受損，即使缺氧也不能有效激活HIF-1α，使其發(fā)揮內(nèi)源性保護(hù)作用。而DFO組與DFO+SPostC組的HIF-1α蛋白表達(dá)明顯升高，并且心肌梗死面積減少，這與Luciano等[11]的研究結(jié)論一致。說明HIF-1α可能是糖尿病狀態(tài)下SPostC保護(hù)效果弱化的關(guān)鍵，去鐵胺預(yù)處理能夠激活糖尿病狀態(tài)下受損的HIF-1α，去鐵胺聯(lián)合SPostC能夠激活并上調(diào)糖尿病狀態(tài)下受損的HIF-1α，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

VEGF是最重要的血管生成細(xì)胞因子，也是HIF-1α的下游靶基因，在缺氧性疾病的血管新生過程中扮演關(guān)鍵角色[12]。VEGF 作用于靶細(xì)胞-血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有一定的特異性，可通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂及增殖，促進(jìn)組織新生血管形成[13]。在心肌發(fā)生缺血時，VEGF表達(dá)增加[14]，可以通過囊泡小體介導(dǎo)的跨膜途徑，引起血漿蛋白外滲，導(dǎo)致細(xì)胞外環(huán)境發(fā)生變化，提高血管的通透性[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在非糖尿病狀態(tài)下，七氟醚能夠上調(diào)VEGF的表達(dá)，一方面能夠促進(jìn)血管重構(gòu)和內(nèi)皮化，另一方面還發(fā)揮抗炎作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)DFO+SPostC組與DFO組相比，VEGF表達(dá)水平明顯增加，線粒體結(jié)構(gòu)損傷程度較輕，心肌梗死面積明顯減少，這提示去鐵胺聯(lián)合SPostC可能通過激活并促進(jìn)糖尿病狀態(tài)下HIF-1α的表達(dá)，上調(diào)下游靶基因VEGF的表達(dá)，最終減少心肌梗死面積，減輕缺血心肌的損傷。

綜上所述，去鐵胺預(yù)處理聯(lián)合SPostC可以激活并促進(jìn) HIF-1α高表達(dá)，上調(diào)VEGF 的表達(dá)，增加缺血心肌的微血管密度，提高血管通透性，減少糖尿病大鼠的心肌梗死面積并改善心功能。本研究揭示了病理性心肌應(yīng)用SPostC心肌保護(hù)作用弱化的分子機制，也為圍術(shù)期應(yīng)用SPostC實施病理性心肌保護(hù)提供了科學(xué)依據(jù)。