配對(duì)相關(guān)的同源異型框1導(dǎo)入棕色脂肪干細(xì)胞構(gòu)建生物起搏

生物起搏是通過(guò)誘導(dǎo)類(lèi)竇房結(jié)樣細(xì)胞的產(chǎn)生，構(gòu)建類(lèi)似于竇房結(jié)的起搏位點(diǎn)以替代原受損的起搏細(xì)胞，使病態(tài)竇房結(jié)綜合征患者獲得正常生理活動(dòng)所需的起搏心率。在心血管胚胎發(fā)育期間，心臟搏動(dòng)位點(diǎn)首先位于左側(cè)，后逐漸轉(zhuǎn)移至右側(cè)，左側(cè)的搏動(dòng)位點(diǎn)消失，Nodal-Pitx2信號(hào)通路在心臟左側(cè)的偏側(cè)性表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮了不可替代的作用[1]。研究證明，在斑馬魚(yú)的胚胎發(fā)育期，配對(duì)相關(guān)的同源異型框(prrx)1在心臟右側(cè)循環(huán)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其在右側(cè)靜脈竇角的表達(dá)明顯高于左側(cè)，Prrx1敲除后右側(cè)靜脈竇發(fā)育不全，心房體積小，但動(dòng)脈極未受明顯影響，并且Prrx1在心臟后極與胰島素基因增強(qiáng)子結(jié)合蛋白1(ISL-1)共表達(dá)，Prrx1敲除后無(wú)法檢測(cè)到胚胎竇房結(jié)重要標(biāo)志物TBX18和ISL-1的表達(dá)[2]。本研究旨在探討Prrx1與竇房結(jié)發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系，闡述Prrx1在生物起搏中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.2 大鼠棕色脂肪干細(xì)胞(BADSC)的原代培養(yǎng)及鑒定

將SD大鼠脫頸處死，75%乙醇浸泡10 min，無(wú)菌條件下取大鼠肩胛間區(qū)皮下脂肪組織置于培養(yǎng)皿中， PBS清洗后剪碎，加入Ⅰ型膠原酶，37 ℃振蕩消化60 min，1 500 r/min離心10 min，除去上層脂肪及上清，收集所得的細(xì)胞沉淀物，加入含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。

培養(yǎng)48 h后換液，PBS沖洗后加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液。以后每48 h換液1次，細(xì)胞融合至80%時(shí)傳代，傳至第3代備用。

在顯微鏡下觀察原代及傳代細(xì)胞形態(tài)變化。取第3代細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，加入CD90、CD45單克隆抗體，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原陽(yáng)性率。

1.3 Prrx1-GFP腺病毒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

采用 AdMax 腺病毒包裝系統(tǒng)進(jìn)行腺病毒包裝，將攜帶Prrx1的腺病毒穿梭質(zhì)粒與不攜帶腺病毒大部分基因組(E1/E3 缺失)的輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞，酶切產(chǎn)生攜帶Prrx1的非復(fù)制型重組腺病毒，PCR擴(kuò)增Prrx1 ORF序列，將處理好的目的片段與載體連接，得到重組腺病毒質(zhì)粒pH-BAd-MCMV-GFP-Prrx1。

將BADSC種于24孔板內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)后根據(jù)感染復(fù)數(shù)(MOI)值0、10、20、50、100、200分別加入帶有GFP和帶有Prrx1基因的腺病毒，以不引起明顯細(xì)胞病變的最大MOI值作為最適宜MOI。將BADSC接種于6孔板，隨機(jī)分為Ad-GFP組和Ad-Prrx1組。Ad-Prrx1組轉(zhuǎn)染Prrx1腺病毒(Ad-Prrx1-GFP)，Ad-GFP組轉(zhuǎn)染Ad-GFP作為對(duì)照。熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄培養(yǎng)24 h、48 h后的細(xì)胞形態(tài)。

1.4 免疫熒光檢測(cè)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒7 d后，4%多聚甲醛冰上固定10～15 min，分別加入HCN4、TBX18或ISL-1一抗4 ℃孵育過(guò)夜，熒光二抗室溫孵育1 h，采用DAPI染核10 min后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)

采用qRT-PCR檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染7 d后細(xì)胞TBX18、ISL-1、Pitx2及HCN4 mRNA的表達(dá)水平，β-Actin為內(nèi)參。采用Trizol試劑提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度。cDNA的合成體系：5×Reaction Buffer 2.0 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，Oligo dT 1.0 μL，RNase Inhibitor 1.0 μL，總RNA 13 μL (2 μg)，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL；37 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min。使用SYBR Green Ⅰ PCR試劑盒進(jìn)行PCR，引物見(jiàn)表1。每個(gè)樣品均作3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)，用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR引物信息

1.6 Western blot檢測(cè)

病毒轉(zhuǎn)染7 d后，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。β-actin(1∶10 000)、ISL-1(1∶500)、TBX18(1∶500)、HCN4(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，羊抗大鼠HRP(1∶10 000)二抗孵育30 min，化學(xué)發(fā)光法顯影。各條帶掃描后采用圖像分析系統(tǒng)分析平均灰度值，以β-Actin為內(nèi)參計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 膜片鉗If電流的記錄

使用Axopatch 700B放大器以全細(xì)胞膜模式記錄起搏電流。BADSC轉(zhuǎn)染病毒7 d后，記錄細(xì)胞If電流。細(xì)胞外液的配制(mmol/L)：NaCl 138，KCl 5，CaCl22，葡萄糖10，MgCl20.5，HEPES 10，用NaOH調(diào)定pH值至7.4。電極內(nèi)液的配制(mmol/L)：谷氨酸鉀 130，KCl 9，NaCl 8，MgCl20.5，HEPES 10，EGTA 2，Mg-ATP 5，用NaOH調(diào)定pH值至7.2。If電流的刺激程序：鉗制電壓-35 mV，再以-10 mV為歩階從-35 mV降至-140 mV，時(shí)程為2 s。記錄時(shí)胞外液加入BaCl24 mmol/L以阻斷超極化激活的內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)，予以2 mmol/L CsCl對(duì)記錄到的If電流進(jìn)行鑒定。采用pCLAMP 6.0.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的記錄與分析處理。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)GrapdhPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BADSC形態(tài)、表型鑒定及病毒轉(zhuǎn)染

急性分離棕色脂肪組織，培養(yǎng)后48 h首次換液，可見(jiàn)散在單個(gè)的BADSC貼壁，呈長(zhǎng)梭形。以后每48 h換液，5～7 d后細(xì)胞形態(tài)較為均一，細(xì)胞呈旋渦樣生長(zhǎng)，可見(jiàn)集落形成。細(xì)胞傳代至3代后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)示細(xì)胞CD90陽(yáng)性率92.8%，CD45陽(yáng)性率<1.2%，見(jiàn)圖1。腺病毒轉(zhuǎn)染BADSC，不引起明顯細(xì)胞病變的病毒轉(zhuǎn)染最適宜MOI值為100，見(jiàn)圖2。轉(zhuǎn)染的GFP和Prrx1均帶有綠色熒光，轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞熒光表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)。

注：A、B分別為培養(yǎng)48 h、7 d的BADSC(×100)；C為流式細(xì)胞術(shù)鑒定BADSC

注：A、B、C、D、E、F中感染復(fù)數(shù)(MOI)值分別為0、10、20、50、100和200

2.2 過(guò)表達(dá)Prrx1能增加竇房結(jié)相關(guān)因子的表達(dá)

腺病毒轉(zhuǎn)染7 d后檢測(cè)兩組細(xì)胞TBX18、ISL-1、HCN4的mRNA和蛋白表達(dá)水平以及Prrx1、Pitx2的mRNA表達(dá)水平。與Ad-GFP組相比，Ad-Prrx1組中的Prrx1、TBX18、ISL-1和HCN4的mRNA表達(dá)水平明顯升高，而Pitx2的表達(dá)水平明顯降低(P均<0.05)。與Ad-GFP組相比，Ad-Prrx1組中的TBX18、ISL-1和HCN4的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P均<0.05)。見(jiàn)表2、圖3。

表2 兩組竇房結(jié)相關(guān)因子mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較

圖 3 兩組TBX18、ISL-1及HCN4的蛋白表達(dá)水平

2.3 Prrx1與TBX18、ISL-1共表達(dá)

免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腺病毒轉(zhuǎn)染7 d后Ad-Prrx1組可見(jiàn) HCN4、TBX18、ISL-1與Prrx1在BADSC中共表達(dá)，Ad-GFP組未發(fā)現(xiàn)上述蛋白共表達(dá)。見(jiàn)圖4。

2.4 過(guò)表達(dá)Prrx1能誘導(dǎo)BADSC產(chǎn)生起搏電流

在倒置熒光顯微鏡下篩選出胞膜較為光滑且同時(shí)表達(dá)綠色熒光的長(zhǎng)梭狀細(xì)胞，進(jìn)行起搏電流檢測(cè)，見(jiàn)圖5A。腺病毒轉(zhuǎn)染7 d后膜片鉗可在Ad-Prrx1組中記錄到If電流，當(dāng)在細(xì)胞外液中加入4 mmol/L的CsCl后，該電流被阻斷，洗脫阻斷劑CsCl后，內(nèi)向電流可恢復(fù)，且該內(nèi)向電流呈現(xiàn)電壓依賴(lài)性，隨著電壓的減小而逐漸減??；而在Ad-GFP組中未記錄到該超極化激活的內(nèi)向電流，見(jiàn)圖5B、5C。

圖 4 兩組Prrx1與TBX18、ISL-1及HCN4的共表達(dá)情況

3 討論

近年來(lái)構(gòu)建竇房結(jié)起搏樣細(xì)胞的方式大致可分為4種：(1)以基因?qū)霝榛A(chǔ)，如通過(guò)導(dǎo)入各種編碼離子通道的基因，抑制KCNJ2基因[編碼內(nèi)向整流鉀離子通道(Ik1)][3]或超極化激活環(huán)核苷酸門(mén)控通道(HCN，編碼If電流)[4]。(2)通過(guò)干細(xì)胞移植誘導(dǎo)人類(lèi)胚胎干細(xì)胞向竇房結(jié)樣細(xì)胞分化[5]。(3)融合細(xì)胞-基因的方法，如將T-box家族中轉(zhuǎn)錄因子TBX18導(dǎo)入多能干細(xì)胞(iPSC)中，誘導(dǎo)出類(lèi)竇房結(jié)細(xì)胞[6]。(4)體細(xì)胞重編程，如直接構(gòu)建帶有TBX18的病毒，將其注入成年豬的心室肌細(xì)胞[7]，誘導(dǎo)形態(tài)和功能與結(jié)樣細(xì)胞相似的細(xì)胞。

注：A為倒置熒光鏡下轉(zhuǎn)染腺病毒后用于膜片鉗記錄的BADSC(×200)；B為起搏電流If的電壓-電流曲線(xiàn)(n=8)；C上圖為Prrx1組所記錄到的內(nèi)向電流，下圖為CsCl阻斷后的電流

生物起搏器的研發(fā)可以借鑒竇房結(jié)的胚胎發(fā)育過(guò)程。 TBX18和ISL-1作為竇房結(jié)早期發(fā)育的標(biāo)志蛋白，在竇房結(jié)的胚胎發(fā)育期間高表達(dá)。研究表明，TBX18和ISL-1單獨(dú)作用于心肌細(xì)胞或者干細(xì)胞能誘導(dǎo)出類(lèi)竇房結(jié)細(xì)胞，從而構(gòu)建生物起搏[8-9]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的參與竇房結(jié)胚胎期發(fā)育的因子主要包括：TBX18、TBX3[10]、shox2[11-12]、ISl-1[13]、Nkx2.5[14]等轉(zhuǎn)錄因子，HCN4[15]、L型鈣通道、鈉鈣交換體等離子通道，細(xì)胞表面黏附分子CD166[16]，縫隙連接蛋白Cx45、Cx43等。

Prrx1與shox2為同源基因，兩者在胚胎期骨骼和心血管的發(fā)育中起重要作用。Bergwerff等[17]研究發(fā)現(xiàn)Prrx1存在于間質(zhì)，參與細(xì)胞基質(zhì)的分化，在胚胎中表達(dá)于中胚層和神經(jīng)嵴，敲除Prrx1可導(dǎo)致動(dòng)脈導(dǎo)管錯(cuò)位、主動(dòng)脈弓不能正常彎曲、右側(cè)鎖骨下動(dòng)脈向后異常傾斜等血管異常。此外，Prrx1還可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞擴(kuò)增，與Prrx2一起調(diào)控肺血管病[18]。在成人中，Prrx1突變可引起心房顫動(dòng)，Prrx1突變還可影響心臟的動(dòng)作電位時(shí)程，從而增加房顫的易感性[19-20]。

Ocana等[2]研究發(fā)現(xiàn)Prrx1在胚胎期與TBX18、ISL-1共表達(dá)，敲除Prrx1可導(dǎo)致靜脈竇區(qū)幾乎不表達(dá)TBX18、ISL-1。但Prrx1在竇房結(jié)發(fā)育過(guò)程中的作用尚未明確，本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)過(guò)表達(dá)Prrx1能增加BADSC竇房結(jié)相關(guān)因子TBX18、ISL-1和HCN4的表達(dá)，且能在該細(xì)胞上記錄到起搏I(xiàn)f電流，提示過(guò)表達(dá)Prrx1能誘導(dǎo)出類(lèi)竇房結(jié)細(xì)胞。因此，我們推測(cè)Prrx1可能作為上游調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)TBX18和ISL-1的表達(dá)，在生物起搏中發(fā)揮作用。此外，過(guò)表達(dá)Prrx1還能抑制Pitx2的轉(zhuǎn)錄水平，提示其可能通過(guò)抑制Pitx2在心臟右側(cè)表達(dá)，從而避免Pitx2對(duì)右側(cè)起搏位點(diǎn)的抑制作用，此結(jié)果與Ocana等的研究結(jié)果一致，但Prrx1與Pitx2的相互作用仍值得進(jìn)一步探究。

本研究有一定的局限性，僅發(fā)現(xiàn)Prrx1能影響細(xì)胞竇房結(jié)相關(guān)因子的表達(dá)，未研究其對(duì)心率的影響；僅以BADSC為研究對(duì)象，Prrx1對(duì)心肌細(xì)胞及iPSC的功能影響未能闡明。未來(lái)尚需在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證Prrx1誘導(dǎo)類(lèi)竇房結(jié)細(xì)胞的作用。