自噬基因LC3、Beclin1在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義

隋曉宇 張貴宇 劉 堯 楊兆杰

（1 山東大學(xué)，山東 濟(jì)南 250000；2 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 濟(jì)南250012；3 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江 齊齊哈爾 161041）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是育齡婦女高風(fēng)險(xiǎn)和常見(jiàn)的疾病，是指具有活性的子宮內(nèi)膜細(xì)胞種植在卵巢、腹膜、膀胱、直腸等部位，從而導(dǎo)致下腹痛、不孕等癥狀。EMs具有與惡性腫瘤類(lèi)似生長(zhǎng)特性，治療棘手。近年來(lái)，該病發(fā)病率逐年上升，達(dá)10%～20%，不孕婦女中，發(fā)病率可達(dá)30%～40%[1]。由于EMs的內(nèi)膜細(xì)胞無(wú)限制生長(zhǎng)，向周邊浸潤(rùn)，可造成廣泛的粘連，且具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高、疼痛等特點(diǎn)，因此被稱(chēng)為婦科“良性癌”。

目前，EMs發(fā)病機(jī)制研究不明，存在多種學(xué)說(shuō)，如經(jīng)血逆流、化生內(nèi)膜、良性轉(zhuǎn)移、免疫防御功能缺陷、醫(yī)源性?xún)?nèi)膜移植學(xué)說(shuō)等?！敖?jīng)血逆流”學(xué)說(shuō)是目前廣泛受到認(rèn)可的理論，經(jīng)期中發(fā)生逆流的經(jīng)血會(huì)使子宮內(nèi)膜組織發(fā)生異位，此時(shí)若機(jī)體局部的免疫應(yīng)答出現(xiàn)異常、就會(huì)造成EMS的發(fā)生。近年來(lái)，郎景和又提出了“在位內(nèi)膜決定論”，他認(rèn)為在位內(nèi)膜的生理特征異常是EMs發(fā)生的直接影響因素，在位內(nèi)膜的周?chē)⒂^(guān)結(jié)構(gòu)及成分則是影響EMs發(fā)病及進(jìn)展的關(guān)鍵因素[2]。

臨床采用內(nèi)分泌及手術(shù)為主的方法治療EMs，但效果均不理想。目前發(fā)現(xiàn)自噬的調(diào)控機(jī)制在EMs的發(fā)生發(fā)展中有一定作用[3]。自噬調(diào)節(jié)與多種自噬基因有關(guān)，微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）和Beclin-1是目前所知的調(diào)控自噬的重要基因。本研究通過(guò)檢測(cè)LC3、Beclin1在EMs和正常人的腹腔液、血清以及子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，探討LC3、Beclin1在EMs發(fā)生發(fā)展中所起的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料：選擇2016年1月至2017年12月期間入住我院的EMs患者和非EMs患者。EMs組共42例，年齡21～42歲，平均年齡（29.5±6.0）歲；同期住院的非EMs患者共42例，年齡18～40歲，平均年齡（31.5±5.0）歲，兩組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組患者平均月經(jīng)周期（28.59±3.27）d，平均經(jīng)期（6.45±0.50）d。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集：抽取兩組患者空腹外周靜脈血5 mL，12000 r/min，離心10 min，用移液器取上清液移至高壓滅菌過(guò)的1.5 mL EP管中，保存至-20 ℃冰箱，在腹腔鏡下抽吸沒(méi)被血液污染的腹腔液，3000 r/min，離心10 min，取上清液置于-20 ℃冰箱保存。子宮內(nèi)膜組織的采集，患者在月經(jīng)后3～7 d用一次性子宮內(nèi)膜吸引器吸取少量子宮內(nèi)膜，取增生期子宮內(nèi)膜，將新鮮的子宮內(nèi)膜組織經(jīng)RNAlater處理后放入液氮中快速冷卻，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）：提取各組血清4 ℃ 12000 rpm/min離心10 min，提取腹腔液上清液，4 ℃ 3000 rpm/min離心10 min后，取上清液移至1.5 mL離心管中，分別檢測(cè)LC3和Beclin1的濃度。最后用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450 nm處測(cè)定吸光度值（OD），將零孔設(shè)為對(duì)照孔，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，曲線(xiàn)的縱坐標(biāo)設(shè)為OD值，而曲線(xiàn)橫坐標(biāo)設(shè)為濃度大小，依據(jù)樣品的OD在坐標(biāo)上找出相應(yīng)的濃度。標(biāo)準(zhǔn)品用于做復(fù)孔檢測(cè)，取均值計(jì)算直線(xiàn)相關(guān)方程系數(shù)，從而建立標(biāo)準(zhǔn)方程。每個(gè)樣品均做復(fù)孔，取均值并記錄，代入上述的回歸方程中計(jì)算出各樣品濃度。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）：將新鮮的子宮內(nèi)膜組織用RNAlater處理。利用研磨棒將子宮內(nèi)膜組織研磨至粉末狀，使用Trizol試劑裂解少量?jī)?nèi)膜組織，提取總RNA，并使用Nanodrop采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)量其波長(zhǎng)在260 nm和280 nm處的OD，并記錄RNA的純度和濃度。按照說(shuō)明書(shū)中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配置：總體積為10 μL，其中，dNTP混合物0.4 μL、RNA酶抑制劑0.5 μL、10×RT Buffer 1 μL、隨機(jī)引物1 μL、蒸餾水和RNA的總體積為2.9 μL，使得RNA的總質(zhì)量為500 ng，將所有混合物混合過(guò)程中均在冰盒上操作，混合后在逆轉(zhuǎn)錄儀器上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-qPCR，PCR引物由吉?jiǎng)P基因公司合成。擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，變性、退火、延伸共循環(huán)40次。結(jié)束前72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。LC3、Beclin1 mRNA水平用GAP作為內(nèi)參基因，基因的表達(dá)用△△Ct法定量分析，計(jì)算LC3、Beclin1 mRNA 表達(dá)水平。見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以“”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，療效等級(jí)資料以率表示，采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EMs和非EMs患者血清中LC3和Beclin1表達(dá)水平及比較：與非EMs組相比，EMs組的血清中LC3和Beclin1的表達(dá)顯著降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組患者血清中LC3和Beclin表達(dá)水平比較

表2 兩組患者血清中LC3和Beclin表達(dá)水平比較

組別 例數(shù) LC3(μg/L) Beclin1(μg/L)EMs組 42 37.86±16.66 24.16±8.76非EMs組 42 76.34±16.19 56.45±16.44

2.2 EMs和非EMs患者腹腔液中LC3和Beclin1表達(dá)水平及比較：與非EMs組相比，EMs組的腹腔液中LC3和Beclin1的表達(dá)明顯下降，與血清中的趨勢(shì)一致，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 兩組患者腹腔液中LC3和Beclin1表達(dá)水平比較

表3 兩組患者腹腔液中LC3和Beclin1表達(dá)水平比較

組別 例數(shù) LC3(μg/L) Beclin1(μg/L)EMs組 42 18.24±9.61 11.15±4.04非EMs組 42 38.07±10.86 21.32±5.06

2.3 EMs和非EMs患者子宮內(nèi)膜組織中LC3和Beclin1表達(dá)水平及比較：與非EMs組相比，EMs組的子宮內(nèi)膜組織中LC3和Beclin1 mRNA的表達(dá)顯著降低，與之前結(jié)果一致，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

3 討 論

EMs雖然屬于良性疾病，其生長(zhǎng)模式和生物學(xué)特征卻與惡性腫瘤相似，曾有“女性盆腔沙塵暴”和“良性癌癥”之稱(chēng)。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且尚不清楚，目前認(rèn)為可能與遺傳物質(zhì)、甾體激素類(lèi)藥物、環(huán)境因素、免疫分子等多種生物活性因素相關(guān)。

圖1 在兩組患者的內(nèi)膜組織中，檢測(cè)LC3、Beclin1 mRNA

近年來(lái)，人們對(duì)分子生物學(xué)的研究日益成熟，EMs與細(xì)胞因子之間的潛在關(guān)聯(lián)也越來(lái)越被關(guān)注和重視。自噬是指在真核細(xì)胞中，細(xì)胞利用溶酶體進(jìn)行自我清除和降解自身受損的細(xì)胞器，在應(yīng)激狀態(tài)下提供細(xì)胞所需的氨基酸和脂肪酸，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。自噬是細(xì)胞為了使自身避免損傷、將有害物質(zhì)清除以及修復(fù)基因突變所帶來(lái)的損傷，所做出的一種適應(yīng)性反應(yīng)[4]。自噬過(guò)程與多種自噬基因有關(guān)，其中，LC3和Beclin1是重要的自噬基因[5]。LC3屬于A(yíng)TG8的同系物，存在于哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞中。由于LC3位于自噬體膜的表面，因此該基因被認(rèn)為是自噬膜的標(biāo)記，具有特異性，可作為膜受體參與多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]。后來(lái)LC3被認(rèn)定為觀(guān)察自噬是否發(fā)生的一個(gè)標(biāo)志性蛋白。Beclin-1，位于17q21上，有文獻(xiàn)報(bào)道，在卵巢癌和自發(fā)性乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有近一半的比率存在17q21染色體對(duì)偶基因缺失，還有研究者在小鼠實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)在Beclin 1的對(duì)偶基因去除的實(shí)驗(yàn)鼠中，其肝癌、淋巴癌及肺癌的發(fā)病率明顯高于對(duì)照組，可見(jiàn)，Beclin 1也是一種抑癌基因。

本實(shí)驗(yàn)中，我們收集了84例患者的血清、腹腔液及子宮內(nèi)膜組織，其中42例EMs患者，42例非EMs患者。在兩組患者的血清和腹腔液中分別檢測(cè)LC3和Beclin1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與非EMs相比，EMs患者的血清和腹腔液中LC3和Beclin1的表達(dá)顯著降低；此外，我們利用RT-qPCR檢測(cè)了兩組患者的子宮內(nèi)膜組織中LC3和Beclin1 mRNA的水平。結(jié)果表明，與非EMs相比，LC3和Beclin1 mRNA在EMs患者中呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上表明，LC3和Beclin1在EMs患者中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)。

綜上所述，LC3和Beclin1參與EMs發(fā)生發(fā)展，探究?jī)煞N基因與EMs發(fā)生的關(guān)聯(lián)，可為EMs的發(fā)病機(jī)制提供重要的理論依據(jù)，并為臨床提供治療EMs開(kāi)拓新的思路和提供有效標(biāo)志物。