布魯氏菌Omp16蛋白的原核表達(dá)與鑒定

李俊萱，吳勝昔，曾 政，李令臣，魯友銘，侯力嘉，李 志，徐 緣，李 紅

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054；2.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心， 重慶 401120)

布魯氏菌病(brucellosis)(簡稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)引發(fā)的目前世界上流行廣、危害大的人獸共患病之一。在全球200多個(gè)國家和地區(qū)中，170多個(gè)國家和地區(qū)都存在和流行布魯氏菌病，并且主要集中在發(fā)展中國家[1]。布魯氏菌也被列為失能性生物戰(zhàn)劑之一，有可能被恐怖主義用來制造恐怖事件[2]。就世界范圍而論,因布魯氏菌病造成的直接經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)每年可達(dá)數(shù)十億美元[3-5]。近年來隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，畜牧業(yè)的快速發(fā)展，牛羊交易頻繁，且交易范圍廣，布病疫情自20世紀(jì)90年代中期開始再次持續(xù)快速上升，目前已成為我國發(fā)病率上升速度最快的傳染病之一[6]。

布魯氏菌是一種無芽孢、無鞭毛、不能運(yùn)動、革蘭氏陰性胞內(nèi)寄生的球桿狀微小細(xì)菌[7]。布魯氏菌的外膜包括脂多糖、蛋白質(zhì)和磷脂層，外膜蛋白是布魯氏菌的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，它除了可以維持細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性外，也是布魯氏菌重要的抗原和毒力因子[8]。 Ompl6蛋白是一種具有免疫保護(hù)作用的外膜抗原[9]，它是第一個(gè)無需外部佐劑就能達(dá)到與活弱毒疫苗相同免疫保護(hù)水平的布魯氏菌蛋白[10]。本課題構(gòu)建pET28a(+)-Ompl6重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化出濃度及純度較高的Omp16蛋白，為后續(xù)布魯氏菌病的檢測試劑研制及單克隆抗體的制備提供素材。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，購自上海維地生物技術(shù)有限公司；原核表達(dá)載體pET28a(+)，由重慶理工大學(xué)D314實(shí)驗(yàn)室本課題組保存；布魯氏菌Omp16質(zhì)粒及top10菌株交由生工生物工程股份有限公司構(gòu)建。

1.2 主要試劑及儀器

快切酶 NdeI、XhoI，均購自寶生物工程有限公司；卡那霉素，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；IPTG，購自索來寶科技有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒，購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，購自SMOBIO公司；HRP-羊抗小鼠IgG，購自Proteintech公司；His-tag組氨酸單抗，購自Sigma公司；全波長酶標(biāo)儀，購自Thermo Fisher Scientific公司；NGCTM色譜系統(tǒng)購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；Bio-ScaleTM親和層析鎳柱、超靈敏多功能成像儀，均購自美國GE公司。

1.3 序列分析、合成

根據(jù)GenBank發(fā)表的布魯氏菌Omp16基因序列 (GenBank登錄號： JF918760.1)，分析序列并進(jìn)行密碼子優(yōu)化，交由上海生工生物工程股份有限公司全基因合成并測序。

1.4 pET28a(+)-Omp16重組載體的構(gòu)建

用高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒從構(gòu)建的top10甘油菌提取質(zhì)粒，并將提取的Omp16質(zhì)粒用快切酶NdeI和XhoI同時(shí)雙酶切，以鑒定質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。將鑒定正確的Omp16質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，并用甘油保菌。

1.5 Omp16重組蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件的篩選

將重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3) 37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600 nm值在0.6～0.8之間，按IPTG濃度梯度(0.1、0.5、1 mmol/L)、溫度梯度(16、25、30、37 ℃)以及時(shí)間梯度(4、6、8、10 h)逐步進(jìn)行篩選，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測，以確定最佳誘導(dǎo)條件。

1.6 Omp16重組蛋白的大量表達(dá)及純化

將重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3) 37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600 nm值在0.6～0.8之間，按照篩選的最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)，并收集菌體。對菌體進(jìn)行超聲破碎后，用8M尿素溶解包涵體，采用親和層析鎳柱對Omp16目的蛋白進(jìn)行純化。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western-blot)分析

將SDS膠面蛋白電轉(zhuǎn)(250 mA,40 min)至PVDF膜，用1%BSA(TBST配置)封閉1 h，棄封閉液，TBST洗3次，每次5 min；以His-tag組氨酸單抗為一抗(1∶10 000)，以HRP羊抗鼠IgG為二抗(1∶4 000)，室溫孵育各1 h，將膜加入ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑顯色，最后用Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET28a(+)-Omp16的酶切鑒定

重組質(zhì)粒pET28a(+)-Omp16經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切后，酶切產(chǎn)物大小與預(yù)期一致(圖1)。

M.DL-2 000 Marker；1.pET28a(+)；2.重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。

2.2 重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)誘導(dǎo)條件的篩選

首先篩選最適誘導(dǎo)溫度，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明Omp16重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)(見圖2)，故采用37 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)；37℃、IPTG濃度分別為0.1、0.5、1 mmol/L誘導(dǎo)6 h，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明IPTG濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)結(jié)果最佳(見圖3); 37℃、0.1 mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)4、6、8、10 h，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，6 h蛋白表達(dá)量最高(見圖4)。故最佳誘導(dǎo)條件為37℃、IPTG為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)6 h，如圖2、3、4所示。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET28a(+)-Omp16超聲破碎后沉淀；2、4、6、8：16、25、30、37 ℃(0.5 mmol·L-1IPTG,10 h)條件下重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)經(jīng)裂解液破碎后的上清；3、5、7、9：16、25、30、37 ℃(0.5 mmol·L-1IPTG,10 h)條件下重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)經(jīng)裂解液破碎后的沉淀。

圖2 不同誘導(dǎo)溫度條件下的Omp16蛋白表達(dá)

2.3 Omp16重組蛋白純化及Western-blot分析

按篩選的最佳誘導(dǎo)條件，對Omp16蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)，用8M尿素溶解包涵體，采用親和層析鎳柱對Omp16目的蛋白進(jìn)行純化，并經(jīng)15%SDS-PAGE檢測，如圖5所示。Western-blot檢測結(jié)果表明：純化的重組Omp16蛋白能夠被His-tag組氨酸單抗識別，于21 ku處出現(xiàn)陽性條帶，與預(yù)期相符(圖6)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET28a(+)-Omp16超聲破碎后沉淀；2.pET28a(+)空載體；3、5、7：37 ℃條件下，IPTG濃度分別為0.1、0.5、1 mmol·L-1，誘導(dǎo)6 h后重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)經(jīng)裂解液破碎后的上清；4、6、8：37 ℃條件下，IPTG濃度分別為0.1、0.5、1 mmol·L-1，誘導(dǎo)6 h后重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)經(jīng)裂解液破碎后的沉淀。

圖3 不同IPTG誘導(dǎo)濃度條件下的Omp16蛋白表達(dá)

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.未誘導(dǎo)對照；2.pET28a(+)空載體；3、4、5、6：37 ℃條件下， IPTG濃度為0.5 mmol·L-1時(shí)分別誘導(dǎo)4、6、8、10 h。

圖4 不同誘導(dǎo)時(shí)間的Omp16蛋白表達(dá)

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET28a(+)-Omp16超聲破碎后沉淀；2.重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3) 經(jīng)裂解液破碎后的沉淀；3.重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3) 經(jīng)裂解液破碎后的上清；4-6：Omp16穿透液；7-9.Omp16純化蛋白。

圖5 純化后的Omp16蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果

1.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)原菌液；2pET28a(+)空載體；3-4.純化后的重組Omp16蛋白。

圖6 Western-blot鑒定重組Omp16蛋白

3 討論

布魯氏菌可感染多種家畜和野生動物，人亦可被感染，人群發(fā)病主要是因?yàn)榻佑|帶菌動物或食用病畜及其乳制品，也可經(jīng)皮膚、粘膜、交配感染，吸血昆蟲也能傳播此病[11]。 布魯氏菌可以通過各種途徑破壞機(jī)體屏障侵入吞噬或非吞噬細(xì)胞。由于其具有躲避巨噬細(xì)胞殺傷作用的能力，布魯菌在宿主體內(nèi)增長迅速，這也是布病易轉(zhuǎn)為慢性病的原因[12]。人感染后臨床主要表現(xiàn)為出現(xiàn)波狀發(fā)熱，多汗，全身乏力，關(guān)節(jié)腫痛，肝脾，淋巴結(jié)和睪丸腫大以及神經(jīng)和生殖系統(tǒng)病變等，嚴(yán)重者喪失生殖和勞動能力。人類在感染布魯氏菌病后由于缺少明顯的癥狀經(jīng)常會造成診斷錯(cuò)誤從而延誤病情，到目前為止也沒有有效的根治方法，只能做到控制和延緩該病的發(fā)作，導(dǎo)致患者在承擔(dān)病痛的同時(shí)還要承擔(dān)巨大的經(jīng)濟(jì)和心理壓力，對我國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)造成較大影響[13]。

布魯氏菌外膜蛋白具有免疫原性和抗原保護(hù)作用[14]。根據(jù)分子量大小將布魯氏菌外膜蛋白分為3組：第1組分子量范圍10～19 ku，是一類脂蛋白；第2組蛋白質(zhì)分子量范圍在36～38 ku，為膜孔蛋白；第3組蛋白為分子量范圍在25～34 ku之間的外膜蛋白[15]。Omp16是一種脂蛋白，它能在所有的布魯氏菌種中表達(dá)，由于其脂質(zhì)部分具有佐劑活性，無需外部佐劑即可誘導(dǎo)小鼠特異性CD4(+)和CD8(+) T細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素，其免疫保護(hù)效果與減毒活疫苗S19相似[9]，而且未脂化Ompl6 的蛋白質(zhì)部分能激活細(xì)胞內(nèi)的樹突狀細(xì)胞，誘導(dǎo)Thl細(xì)胞發(fā)生特異性免疫[10]。熊流新等[16]通過原核表達(dá)獲得Omp16蛋白，并證實(shí)其能夠刺激小鼠產(chǎn)生高滴度的多克隆抗體。王勇等[17]將Omp16蛋白作為包被抗原建立間接ELISA方法檢測布魯氏菌陽性血清，具有良好的免疫反應(yīng)性，并且與常見牛病陽性血清之間無交叉反應(yīng)。因而獲得高純度的Omp16蛋白對于后續(xù)進(jìn)一步研究具有非要重要的意義。

目前布魯氏菌病診斷方法主要包括細(xì)菌學(xué)診斷方法、血清學(xué)診斷方法、分子生物學(xué)檢測方法等[18]。細(xì)菌學(xué)檢查分離率低、耗時(shí)耗力，且布魯氏菌可通過浮塵傳播，危險(xiǎn)程度較高，已經(jīng)逐步被淘汰[19]。血清學(xué)診斷方法操作簡便、迅速，已逐漸得到廣泛的應(yīng)用。墨西哥學(xué)者Dajer等應(yīng)用同質(zhì)熒光偏振試驗(yàn)來診斷牛布魯氏菌病，研究發(fā)現(xiàn)FPA是一種能替代CFT的試驗(yàn)[20]。張付賢等[21]研制了膠體金試紙條檢測小鼠布魯氏菌感染血清，敏感性高，簡便快速。由于血清學(xué)診斷方法靈敏度及特異性較差，且不能區(qū)分疫苗免疫和自然感染，因此難以真正實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確監(jiān)測和診斷疾病。分子生物學(xué)檢測方法所需樣本量少，操作簡單，可以彌補(bǔ)這些方法的不足[22]。分子生物學(xué)診斷技術(shù)包括PCR診斷技術(shù)和基因檢測技術(shù)等。徐軍等[23]建立了檢測乳中布魯氏菌omp22基因的巢式PCR方法，反復(fù)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該檢測方法有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

本研究對布魯氏菌Omp16基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，全基因合成基因片段并構(gòu)建重組質(zhì)粒。通過篩選得到Omp16蛋白的最適誘導(dǎo)條件為37 ℃、0.5 mmol/L,IPTG誘導(dǎo)6h，此時(shí)蛋白表達(dá)量最高，且主要以包涵體的形式存在。用8M尿素溶解包涵體后，采用親和層析鎳柱對Omp16目的蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)15% SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白純度達(dá)到了電泳純。本研究制備的Omp16蛋白將為后續(xù)單克隆抗體的制備和布魯氏菌病的檢測提供了可靠素材。