胃炎康方對慢性非萎縮性胃炎患者胃泌素相關(guān)基因調(diào)控通路影響

彭艷紅 蔣亦昕 白光 王慶峰

摘要：目的 ?采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測胃炎康方的作用靶點(diǎn)，以臨床樣本驗(yàn)證該靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，確定胃炎康方的分子機(jī)制。方法 ?采用隨機(jī)數(shù)字表法將112例慢性非萎縮性胃炎患者分為治療組和對照組各56例。對照組采用西醫(yī)常規(guī)治療;治療組予胃炎康方，每日1劑，水煎，每日2次口服。2組均連續(xù)治療4周。分析2組臨床療效。采用生物信息學(xué)手段挖掘胃炎康方潛在調(diào)控基因，預(yù)測其作用于胃炎的靶點(diǎn)。應(yīng)用免疫組化法分析胃部組織樣本以驗(yàn)證胃炎康方的作用機(jī)制。結(jié)果 ?治療組總有效率為87.5%（49/56），對照組為78.6%（44/56），2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。胃鏡顯示2組胃部病理學(xué)結(jié)構(gòu)均好轉(zhuǎn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對胃炎康方作用的靶基因進(jìn)行預(yù)測，其胃泌素相關(guān)的靶基因包括前列腺素G/H合成酶2、B細(xì)胞κ輕肽基因增強(qiáng)子抑制因子、磷脂酰肌醇-3激酶催化亞基δ及前列腺素F2α受體。并預(yù)測胃炎康方可基由PTGS2→IKBKB的信號通路，抑制胃泌素所致的炎癥反應(yīng)。通過胃炎康方治療的臨床樣本分析，基本驗(yàn)證以上推論。結(jié)論 ?胃炎康方通過對PTGS2、IKBKB、PIK3CD、PTGFR等靶基因的調(diào)控激活相應(yīng)信號通路而發(fā)揮治療作用。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段可快速預(yù)測復(fù)方作用靶點(diǎn)，應(yīng)用該方法可解釋復(fù)方對相關(guān)疾病的治療機(jī)制，并提供新的研究手段。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);生物信息學(xué);慢性非萎縮性胃炎;基因靶點(diǎn);信號通路

中圖分類號：R259.733.1 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）02-0042-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.010

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

?Abstract： Objective To predict the targets of Weiyankang Prescription by means of network pharmacology; To verify the accuracy of the targets with clinical samples to determine the molecular mechanism of Weiyankang prescription. Methods Totally 112 cases of chronic non-atrophic gastritis were divided into treatment group and control group， with 56 cases in each group. The control group was treated with Western medicine， and the treatment group was given Weiyankang Prescription， one dosage a day， decoction， orally twice a day. All were treated continuously for 4 weeks. The bioinformatics method was used to mine the potential regulatory genes of Weiyankang Prescription and predict its target in the treatment of gastritis. The gastric tissue samples were analyzed by immunohistochemistry to verify the mechanism of Weiyankang Prescription. Results The total effective rate was 87.5% （49/56） in the treatment group and 78.6% （44/56） in the control group， without statistical significance （P>0.05）. Gastroscopic examination showed that the pathological structure of the stomach in both groups improved， without statistical significance （P>0.05）. The target genes of Weiyankang Prescription were predicted by network pharmacology. The gastrin-related target genes included： prostaglandin G/H synthetase 2， B cell kappa light peptide gene enhancer inhibitor， phosphatidylinositol-3 kinase catalyzes the subunit δ and prostaglandin F2α receptor. It was predicted that Weiyankang Prescription could inhibit the inflammatory response caused by gastrin by the signal pathway of PTGS2→IKBKB. Through the analysis of clinical samples of Weiyankang Prescription treatment， the above inferences were basically verified. Conclusion Weiyankang Prescription can activate the corresponding signal pathway by regulating the target genes of PTGS2， IKBKB， PIK3CD and PTGFR， to realize the treatment of chronic gastritis. The use of network pharmacology can quickly predict the target of the compound acting on the disease. This method provides a new means to explain the therapeutic mechanism of compound prescription for related diseases.

?Keywords：network pharmacology; bioinformatics; chronic non-atrophic gastritis; gene targets; signal pathway

慢性非萎縮性胃炎（chronic non-atrophic gastritis，CNAG）表現(xiàn)為胃部黏膜處慢性炎癥細(xì)胞浸潤，并未伴隨胃黏膜萎縮性病變，僅影響胃黏膜表層上皮，未至胃黏膜深處腺體。CNAG日久會導(dǎo)致萎縮性胃炎，引發(fā)胃黏膜固有腺體萎縮、腸上皮化生及不典型增生等，增加進(jìn)一步癌變的風(fēng)險(xiǎn)。CNAG發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，其發(fā)病原因與幽門螺桿菌（Hp）感染，膽汁反流，血管活性因子、細(xì)胞因子失調(diào)及免疫相關(guān)因素等有關(guān)^[1]。該病分子靶點(diǎn)涉及血管活性腸肽^[2]、趨化因子10^[3]，及白細(xì)胞介素（IL）-11^[4]等。林志強(qiáng)等^[5]研究表明，TLR信號通路在CNAG發(fā)病過程中具有調(diào)控作用。胃炎康方為遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（以下簡稱本院）院內(nèi)制劑，功效疏肝泄熱、和胃止痛。為探討該方改善胃部炎癥的路徑，本研究對胃炎康方進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，獲取其潛在作用靶點(diǎn)，并通過string數(shù)據(jù)庫找到同上述潛在靶點(diǎn)相關(guān)的互作基因，并檢測胃黏膜樣本，明確上述基因的調(diào)控情況，以探究胃炎康方作用機(jī)制。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

選擇本院消化內(nèi)科2017年1月-2018年1月CNAG患者112例，采用數(shù)字隨機(jī)表法分為對照組和治療組各56例。對照組男性36例，女性20例，平均年齡48.6歲;治療組男性31例，女性25例，平均年齡49.2歲。2組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)由本院倫理委員會審查批準(zhǔn)[2017028ND（KT）-031-07]。

1.2? 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照《中國慢性胃炎共識意見（2017年，上海）》^[6]及《慢性胃炎內(nèi)鏡的分型分級標(biāo)準(zhǔn)及治療的試行意見》^[7]確定診斷標(biāo)準(zhǔn)。①病程較長，且均呈現(xiàn)各種程度的胃脘脹痛;②胃部感覺脹滿，厭食，餐后出現(xiàn)惡心反酸;③內(nèi)窺鏡確診胃部炎癥，目鏡下可見胃部黏膜有紅斑、黏膜皺襞變平甚至消失，胃部黏膜水腫或有滲出，可見血管透出;④胃部經(jīng)內(nèi)窺鏡確認(rèn)，無萎縮癥狀發(fā)生。

1.3? 排除標(biāo)準(zhǔn)

①伴胃部萎縮性病變者;②3個月內(nèi)出現(xiàn)消化系統(tǒng)感染者;③存在其他免疫系統(tǒng)疾病史者;④伴癌癥、器官衰竭等嚴(yán)重疾病者;⑤伴精神疾病及不愿配合本研究開展者。

1.4? 治療方法

對照組采用常規(guī)西醫(yī)治療（克拉霉素、奧美拉唑、曲昔匹特）。治療組予胃炎康方（黃連10 g、蒲公英15 g、梔子15 g、黃芩10 g、佩蘭10 g、佛手10 g、陳皮10 g、砂仁10 g、白術(shù)10 g、甘草5 g，本院藥劑科制備），水煎服，每日1劑，每日2次口服。2組均治療4周。

1.5? 療效標(biāo)準(zhǔn)

參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》^[8]制定。臨床痊愈：臨床癥狀體征消失，胃鏡復(fù)查及病理組織活檢證實(shí)黏膜慢性炎癥明顯好轉(zhuǎn)達(dá)輕度;顯效：臨床主要癥狀體征消失，胃鏡復(fù)查及病理組織活檢證實(shí)黏膜慢性炎癥好轉(zhuǎn);有效：主要癥狀、體征明顯減輕，胃鏡復(fù)查及病理組織活檢證實(shí)慢性炎癥減輕1個級度以上;無效：臨床癥狀無改善，胃鏡復(fù)查及病理組織活檢證實(shí)黏膜慢性炎癥無變化或加重。

1.6? 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

根據(jù)藥物的君臣佐使構(gòu)成，將胃炎康方分為4個簇（cluster）。cluster1為君藥蒲公英、梔子;cluster2為臣藥黃連、黃芩、佩蘭、佛手;cluster3為佐藥陳皮、砂仁、白術(shù);cluster4為使藥甘草。以BATMAN- TCM數(shù)據(jù)庫對胃炎康方進(jìn)行模擬以獲得其作用靶點(diǎn)，其中，設(shè)定劃界分?jǐn)?shù)為20，P值為0.05。根據(jù)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫所獲得的數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果，對所獲得的靶基因進(jìn)行KEGG及GO分析，推測其對應(yīng)的疾病/基因/信號通路信息，并進(jìn)一步進(jìn)行功能富集。

1.7? 靶基因及信號通路驗(yàn)證

PTGS2（abcam公司，Anti-COX2/Cyclooxygenase2抗體，兔單克隆抗體，批號ab21704），IKBKB（abcam公司，Anti-IKKα+IKβ抗體，兔單克隆抗體，批號ab178870），PIK3CD（天津賽爾生物技術(shù)有限公司PIK3CD抗體，兔單克隆抗體，批號SRP01115），PTGFR（abcam公司Anti-PTGFRN抗體，兔多克隆抗體，批號ab224392）。

患者治療前后經(jīng)內(nèi)窺鏡取胃黏膜組織，首先進(jìn)行樣品預(yù)處理，常規(guī)免疫組化法進(jìn)行測定^[9]。組織冷凍切片后，常規(guī)二甲苯脫蠟，水化;3%H₂O₂處理15 min封閉內(nèi)源性的過氧化物酶，5%山羊血清處理30 min封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn);以抗體進(jìn)行孵育，稀釋比例1∶100，過夜。再按說明書選用對應(yīng)的免疫組化檢測試劑孵育，常規(guī)DAB染色，蘇木精復(fù)染，脫水透明后封片。免疫組化染色結(jié)果判定^[10]：隨機(jī)抽選片內(nèi)5個高倍視野（×400）進(jìn)行觀察，無染色陽性細(xì)胞計(jì)0分，染色陽性細(xì)胞百分率<10%計(jì)1分，10%～50%計(jì)2分，>50%～80%計(jì)3分，>80%計(jì)4分。根據(jù)多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)度計(jì)分：無著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。病理閱片及染色積分判定由2名病理醫(yī)師采用雙盲評估法觀察完成。計(jì)算染色強(qiáng)度積分與陽性細(xì)胞百分率積分的乘積，<6分判為低表達(dá)，≥6分判為高表達(dá)^[11]。

1.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 2組臨床療效及胃鏡結(jié)果比較

2組總有效率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

胃鏡顯示，2組患者治療前胃鏡下見黏膜皺襞變平甚至消失，黏膜紅白相間，以白色為主，可見血管透出，炎癥反應(yīng)明顯。2組治療后患者胃部病理學(xué)結(jié)構(gòu)均有好轉(zhuǎn)，可見炎癥好轉(zhuǎn)或消失，血管無透出，黏膜皺襞恢復(fù)。

2.2? 胃炎康方靶基因及信號通路預(yù)測

胃炎康方君臣佐使4個簇中，重疊的靶基因共計(jì)254個。進(jìn)一步對所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以確定其改善胃炎癥狀的信號通路。

最終推知胃炎康方作用于CNAG的主要靶點(diǎn)集中在以下方面。①炎癥抑制：主要基于核因子-κB（NF-κB）信號通路，調(diào)控的靶點(diǎn)為基因IL-1β→NF-κB;②Hp所致胃炎機(jī)制調(diào)控：主要基于對IL-1β的調(diào)控作用;③胃泌素調(diào)控通路^[13]：主要基于PTGS2、IKBKB、PIK3CD、PTGFR基因?qū)崿F(xiàn)對胃酸分泌抑制的調(diào)控。其基因互作關(guān)系（string數(shù)據(jù)庫），預(yù)測作用于胃泌素信號通路的方式（OmicsNet數(shù)據(jù)庫）。

2.3? 臨床樣本驗(yàn)證

選擇部分患者胃黏膜組織進(jìn)行HE染色，依據(jù)全部的觀察組染色片，對PTGS2、IKBKB、PIK3CD、PTGFR基因在治療組治療前后的高表達(dá)情況制作維恩圖。

治療前2例患者的4個對應(yīng)靶基因均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。有患者亦出現(xiàn)了3個或2個靶基因重疊高表達(dá)狀態(tài)。表明所選定的靶點(diǎn)基因與CNAG高度相關(guān)。治療后患者臨床癥狀好轉(zhuǎn)，靶基因表達(dá)大幅下降，在患者組織樣本內(nèi)呈現(xiàn)低表達(dá)或表達(dá)抑制，未出現(xiàn)3個或4個靶基因重復(fù)高表達(dá)，2個以上靶基因重復(fù)高表達(dá)的樣本也大幅降低（由15例降低至3例）。治療后，PIK3CD、PTGFR表達(dá)均大幅下降，僅1例患者呈現(xiàn)PIK3CD高表達(dá)（治療前為15例），2例患者呈現(xiàn)PTGFR高表達(dá)（治療前為22例）。

3? 討論

CANG為胃黏膜上皮遭受反復(fù)損害導(dǎo)致固有腺體的減少，或伴纖維替代腸腺化生和/或假幽門腺化生。發(fā)病過程為正常胃黏膜→Hp感染→急性Hp感染→慢性Hp感染→非萎縮性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→上皮內(nèi)瘤變^[13]，可見，Hp參與了關(guān)鍵環(huán)節(jié)。人體感染Hp后，胃泌素生成明顯增加，刺激胃酸分泌^[14]，從而誘發(fā)/加重胃炎癥狀。故治療上除根除Hp外，還應(yīng)阻遏胃泌素誘發(fā)胃部炎癥反應(yīng)。

本研究顯示，患者胃部病理學(xué)特征明顯改善。為了進(jìn)一步確定其作用機(jī)制，我們應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段對胃炎康方進(jìn)行分析?；诮Y(jié)果預(yù)測可知，胃炎康方直接抑制炎癥，或基于IL-1β分子抑制Hp所致的胃部炎癥。根據(jù)臨床樣本免疫組化結(jié)果可知，胃炎康方主要作用于PTGS2、IKBKB、PIK3CD、PTGFR。PTGS2為雙功能酶，作為前列腺素內(nèi)氧化酶還原酶，具有環(huán)氧化酶和過氧化氫酶活性，可催熟花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，在胃炎發(fā)病的過程中常同胃泌素表達(dá)呈正相關(guān)。有研究顯示，隨著Hp的感染與刺激，患者體內(nèi)胃泌素不斷分泌^[15]，PTGS2在胃部組織內(nèi)表達(dá)亦會上調(diào)^[16]，從而增加組織內(nèi)前列腺素含量，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。從OmicsNet及string數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果可以看出，作為PTGS2的下游蛋白，IKBKB的表達(dá)會隨著PTGS2表達(dá)上/下調(diào)而上/下調(diào)。二者相關(guān)性亦在巨噬細(xì)胞的藥物實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證^[17]。

IKBKB是復(fù)合物中介導(dǎo)NF-κB活化經(jīng)典途徑的關(guān)鍵上游蛋白^[18]，NF-κB又介導(dǎo)后續(xù)的炎癥反應(yīng)。PIK3CD同上游蛋白的IKBKB互相作用，雖并未在胃炎患者的人體內(nèi)證實(shí)，但二者密切相關(guān)，常出現(xiàn)于胰島素代謝異常的患者體內(nèi)^[19]。研究顯示，PIK3CD在胃癌的發(fā)病過程中起到了重要作用，常在胃癌患者的癌旁組織內(nèi)過表達(dá)^[11，20-21]。而且，其在消化系統(tǒng)癌患者的發(fā)病過程中與IKBKB的表達(dá)存在相關(guān)性^[22]。本研究顯示，雖然在患者體內(nèi)IKBKB表達(dá)出現(xiàn)異常，僅2例出現(xiàn)PIK3CD高表達(dá)異常，且治療后均呈現(xiàn)明顯下調(diào)趨勢。由此推測，IKBKB→PIK3CD在萎縮性胃炎→腸上皮化生→上皮內(nèi)瘤變的階段發(fā)揮了重要作用。

同IKBKB→PIK3CD類似，PTGFR表達(dá)仍較低，PTGFR的過表達(dá)常出現(xiàn)于腫瘤或炎癥患者，其可通過ROCK途徑參與膽管等器官纖維化過程^[23-24]。其上游啟動子為COX等酶類。在本研究中，PTGS2與PTGFR的表達(dá)關(guān)系密切。可以推測，隨著萎縮性胃炎的發(fā)生，PTGS2會進(jìn)一步上調(diào)PTGFR，發(fā)生胃壁纖維化，從而介導(dǎo)后續(xù)的腸上皮化生。鑒于本研究僅以CNAG患者為樣本進(jìn)行研究，無法確認(rèn)PIK3CD及PTGFR與患者胃炎發(fā)病分級間的相關(guān)性，其相互關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，胃炎康方可顯著下調(diào)患者黏膜PTGS2、IKBKB表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)二者下游PIK3CD、PTGFR，由此改善患者胃炎癥狀。

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