富血小板纖維蛋白聯(lián)合脂肪干細胞對糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的影響研究

丁寅佳 崔磊 趙旭 司婷婷 趙啟明

[摘要]目的：評價富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）和脂肪干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）對于糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的作用。方法：在18只糖尿病裸鼠和6只正常裸鼠上制成48個皮膚創(chuàng)面，將糖尿病裸鼠創(chuàng)面隨機分為PRF-ADSCs組、PRF組、糖尿病對照組，觀察各組創(chuàng)面愈合情況，并行組織病理學檢查及CD31表達檢測。結(jié)果：PRF存在大量纖維蛋白聚集并形成疏松的立體網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，在交界處有大量血小板和白細胞聚集。在接種ADSCs并培養(yǎng)1周后的PRF中，可見大量ADSCs細胞粘附在PRF的纖維蛋白網(wǎng)絡中。傷后3、7、10、14d，PRF-ADSCs組創(chuàng)面愈合率分別為（35.2±4.2）%、（76.2±5.0）%、（88.3±5.0）%、（97.6±2.7）%，PRF組為（28.0±5.0）%、（62.0±5.2）%、（81.0±3.7）%、（92.3±3.2）%，糖尿病對照組為（16.0±2.7）%、（26.1±4.8）%、（60.9±7.7）%、（72.0±8.1）%，正常對照組為（31.0±4.0）%、（64.8±4.2）%、（83.0±3.5）%、（98.5±2.7）%，PRF-ADSCs組愈合率優(yōu)于其它3組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。PRF-ADSCs組創(chuàng)面愈合時間為（14.75±0.45）d，PRF組為（15.33±0.49）d，糖尿病對照組創(chuàng)面愈合時間為（17.67±0.49）d，正常對照組創(chuàng)面愈合時間為（14.42±0.51）d，PRF-ADSCs組和正常對照組的愈合時間優(yōu)于其余2組（P<0.01）。傷后14d PRF-ADSCs組、PRF組和正常對照組創(chuàng)面毛細血管和組CD31陽性細胞計數(shù)多于糖尿病對照組（P<0.01）。結(jié)論：應用PRF聯(lián)合ADSCs治療糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面，可以顯著促進創(chuàng)面愈合，且效果優(yōu)于單純使用PRF。

[關(guān)鍵詞]富血小板纖維蛋白;血小板;脂肪干細胞;糖尿病小鼠;創(chuàng)面;愈合

[中圖分類號]R622? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）02-0008-06

Abstract： Objective? To evaluate the effects of PRF and ADSCs on skin wound healing in diabetic mice. Methods? 48 skin wounds were made on 18 diabetic nude mice and 6 normal nude mice. Diabetic nude mice wounds were randomly divided into PRF-ADSCs group， PRF group， and diabetes control group. Wound healing was observed in each group and was observed. Pathological examination and detection of CD31 expression of the specimen was made. Results? PRF has a large amount of fibrin aggregation and forms a loose three-dimensional network structure， with a large number of platelet and leukocyte aggregation at the junction. In PRF inoculated with ADSCs and cultured for one week， a large number of ADSCs cells were seen adhering to the PRF's fibrin network. At 3， 7， 10， and 14d after injury， the wound healing rate in the PRF-ADSCs group was （35.2±4.2）%， （76.2±5.0）%， （88.3±5.0）% and （97.6±2.7）% respectively， in the PRF group was （28.0±5.0）%， （62.0±5.2）%， （81.0±3.7）% and （92.3±3.2）% respectively， in diabetic control group was （16.0±2.7）%， （26.1±4.8）%，（60.9±7.7）% and （72.0±8.1）% respectively， and in normal control group was （31.0±4.0）%， （64.8±4.2）%， （83.0±3.5）% and （98.5±2.7）% respectively. The healing rate of PRF-ADSCs group was better than the other three groups， and the differences were statistically significant （P<0.01）. The wound healing time in PRF-ADSCs group was （14.75±0.45）d， in PRF group was （15.33±0.49）d， in diabetic control group was （17.67±0.49）d， and in normal control group was （14.42±0.51）d， The healing time of PRF-ADSCs group and normal control group were better than other two groups （P<0.01）. The counts of capillary and CD31 positive cells in wounds of PRF-ADSCs group， PRF group and normal control group were higher than those of diabetic control group at 14d after injury （P<0.01）. Conclusion? This study found that the use of PRF in combination with ADSCs in the treatment of diabetic skin wounds， can significantly promote wound healing， and the effect is better than simply using PRF.

Key words： platelet-rich fibrin; platelet; adipose derived stem cells; diabetic mice; wound; healing

目前，糖尿病已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)的一種常見疾病。目前針對糖尿病足（diabetic foot ulcers，DFU）患者的治療，除了控制患者全身血糖水平外，在局部創(chuàng)面所采用的傳統(tǒng)治療方法均需要較長的治療時間，加重了患者的經(jīng)濟負擔，甚至最終也未能達到創(chuàng)面愈合。富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）主要由血漿及血小板構(gòu)成，其包含有纖維蛋白支架及聚集于其中的白細胞和各類生長因子、細胞因子、趨化因子等，被廣泛應用口腔、頜面以及整形美容外科等多個醫(yī)學領域[1-3]。目前已有初步研究表明，PRF對于創(chuàng)面愈合具有促進作用[4-5]，應用PRF治療糖尿病創(chuàng)面也具有積極作用[6-7]。隨著干細胞研究的深入，也為治療創(chuàng)面損傷提供了新的方法。脂肪干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）具有來源廣泛，取材方便，對機體損傷小，且具有多向分化潛能，臨床運用前景廣闊的特點[8-9]。本研究以糖尿病裸鼠為研究對象，探討PRF聯(lián)合ADSCs在糖尿病創(chuàng)面修復中的作用，以期為糖尿病創(chuàng)面的治療尋找一種更好的方法。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物與組織材料：本實驗SPF級雄性裸鼠（6～8周齡）由上海交通大學第九人民醫(yī)院動物實驗室提供，實驗方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。裸鼠適應性飼養(yǎng)1周，體重20～22g。

靜脈血標本來自于健康志愿者8例（男女各4例，年齡23～28歲，平均年齡25歲），無傳染性疾病，無相關(guān)血液疾病，女性志愿者未在月經(jīng)期。采血前2周禁煙酒，采血前3個月未服用阿司匹林及其他任何影響血小板功能的藥物。脂肪組織來自于1例健康成人，行腹部脂肪抽吸術(shù)后獲得的脂肪抽吸物100ml。志愿者知情并同意本實驗。

1.2 主要試劑與儀器：鏈脲佐菌素（STZ，sigma公司，美國），DMEM-F12 培養(yǎng)基（Hyclone，美國），胎牛血清（Natocor，阿根廷），Ⅰ型膠原酶（Sigma，美國），蘇木精-伊紅（H-E）染色試劑盒（索萊寶，中國上海），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色試劑盒（碧云天，國上海），CCK-8 試劑盒（Omega，美國），SYBR（TaKaRa，日本），10ml枸櫞酸鈉真空采血管（君諾公司，中國），高速離心機（L500，中國），掃描電鏡（JSM-6700F， 日本），濾光片式酶標儀（ELX800，美國）。

1.3 糖尿病裸鼠模型及創(chuàng)面模型的建立：將裸鼠禁食16h后，將STZ溶于檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液（0.1mol/L，pH4.5）配制成1%的注射液，經(jīng)0.22μmol濾器過濾除菌，以150mg/kg劑量腹腔注射。注射14d后，通過斷尾采血法測定血糖濃度，血糖濃度≥16.7mmol/L視為糖尿病裸鼠造模成功。

取造模成功的18只糖尿病裸鼠（平均血糖濃度23.9±5.6mmol/L）和6只正常裸鼠，采用30g/L戊巴比妥鈉腹腔注射（30mg/kg）麻醉，背部消毒后于脊柱兩側(cè)對稱部位各切除2個直徑為1.0cm深達淺筋膜的圓形全層皮膚，共制成48個創(chuàng)面，創(chuàng)面直徑為（1.13±0.11）cm。采用隨機數(shù)字表法隨機將18只糖尿病裸鼠歸入A組、B組和C組，每組6只，將正常裸鼠歸入D組。A組左側(cè)采用PRF膜片及常規(guī)敷料覆蓋，右側(cè)僅采用常規(guī)敷料覆蓋;B組左側(cè)采用接種ASCs的PRF膜片及常規(guī)敷料覆蓋，右側(cè)采用PRF膜片及常規(guī)敷料覆蓋;C組左側(cè)僅采用常規(guī)敷料覆蓋，右側(cè)采用接種ASCs的PRF膜片及常規(guī)敷料覆蓋;D組僅采用常規(guī)敷料覆蓋。最終獲得4組不同干預方式（PRF-ADSCs組、PRF組、糖尿病對照組、正常對照組）的創(chuàng)面愈合率和愈合時間。所有小鼠分開喂養(yǎng)至傷口完全愈合，每日檢查敷料，使用網(wǎng)套固定確保敷料穩(wěn)固。

1.4 PRF膜片的制備：使用10ml的枸櫞酸鈉真空采血管采集志愿者肘靜脈全血10ml，立即放于離心機中，以400g離心力離心10min，靜置3～5min后可得到纖維蛋白凝塊，介于頂端的少細胞漿液層與底端的紅細胞層之間。剪取PRF凝塊后使用無菌紗布輕壓10s制成PRF膜片。

1.5 ADSCs分離和培養(yǎng)：將獲得的無菌脂肪抽吸獲得物25ml放入50ml離心管中，加入0.075%Ⅰ型膠原酶15ml，在恒溫搖床中37℃消化60min。1 200g離心10min，棄上層液體。加入DMEM-F12重懸接種到25cm培養(yǎng)皿中，置于體積分數(shù)5% CO2，37℃飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，24～48h后換液，PBS沖洗去除血細胞，繼續(xù)培養(yǎng)待細胞生長融合達90%時傳代。取生長良好的第3代ADSCs接種到PRF上，1d后移植到裸鼠傷口進行修復治療。

1.6 檢測指標及評價方法

1.6.1 PRF顯微及超微結(jié)構(gòu)觀察：將制備成功的PRF標本立即浸于10%多聚甲醛固定1d后，常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度為5μm），HE染色，于400倍光學顯微鏡下觀察并采集圖像。將制備成功的PRF標本與接種ADSCs培養(yǎng)1周后的標本浸于大于20倍體積的4℃ 2.5%戊二醛中，存放于4℃冰箱固定2h以上，切取約10.0mm×0.5mm大小樣本，0.1mol/L的PBS漂洗3遍（pH=7.2）;加入1%鋨酸固定2h，再用PBS漂洗3遍，各10min（pH=7.2）;然后以30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脫水（其中100%乙醇脫2遍），每次脫水10min乙酸異戊酯置換20min;CO2臨界點干燥;金離子濺射法鍍膜;掃描電鏡觀察并采集圖像。

1.6.2 創(chuàng)面愈合情況：于傷后3、7、10、14d，肉眼觀察創(chuàng)面變化、肉芽組織生長等情況，同時采用數(shù)碼照相機對所有創(chuàng)面照相，比較創(chuàng)面大小，并通過Image-Pro Plus 6.0軟件測算創(chuàng)面未愈合面積，并計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=（創(chuàng)面初始面積-未愈合面積）/創(chuàng)面初始面積×100%。

1.6.3 創(chuàng)面組織病理學觀察：于傷后14d，將裸鼠30g/L戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射（30mg/kg）麻醉，切取創(chuàng)面及創(chuàng)周3mm組織。將組織立即浸于10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度為5μm），HE染色，于100倍光學顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織病理學改變。采用Image-Pro Plus 6.0軟件采集圖像，每張切片在肉芽組織范圍內(nèi)100倍光學顯微鏡下相同部位選取3個視野，比較各組毛細血管平均數(shù)量。

1.6.4 創(chuàng)面組織CD31表達情況：采用免疫組織化學染色法，取多聚甲醛固定后創(chuàng)面組織切片，常規(guī)抗原修復后，加入體積分數(shù)3%過氧化氫室溫孵育10min，PBS沖洗后置于0.01mmol/L枸櫞酸緩沖液（pH值為6.0）中行微波抗原修復20min，分別加入CD31一抗（稀釋比為1：50），4℃過夜，PBS沖洗后加入增強型兩步法檢測試劑，37℃孵育20min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復染，封片。以細胞呈黃色或棕黃色反應為陽性表達。采用Image-Pro Plus 6.0軟件采集圖像，每張切片在肉芽組織范圍內(nèi)100倍光學顯微鏡下相同部位選取3個視野，比較各組陽性細胞平均數(shù)量。

1.7 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。各組創(chuàng)面愈合率采用重復測量數(shù)據(jù)方差分析，并對組間各不同時間點的數(shù)據(jù)進行比較;各組創(chuàng)面愈合時間、組織毛細血管密度及CD31表達采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2? 結(jié)果

2.1 ADSCs形態(tài)觀察：ADSCs經(jīng)體外分離、培養(yǎng)，24h后即可見細胞爬出。48h首次換液后光鏡下觀察可見：細胞形態(tài)多樣可呈短梭形、三角形、多邊形，細胞散在分布不均一;隨后細胞生長迅速，爬滿整個瓶底;經(jīng)傳代后，細胞形態(tài)均一，為長梭形，且具有一定極性，放射狀排列。

2.2 PRF顯微及超微結(jié)構(gòu)觀察：大體標本可見PRF凝膠為有彈性且質(zhì)韌，表面光滑，質(zhì)地均勻的膠凍狀結(jié)構(gòu)，主體呈淡黃色，底端呈紅色。PRF膜片呈乳白色，質(zhì)韌，表面光亮，底端呈紅色。將PRF標本HE染色后，于400倍光學顯微鏡下可見PRF呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較為疏松，纖維蛋白基質(zhì)紅染，在靠近底層的纖維蛋白基質(zhì)中有大量白細胞聚集，而在上層的纖維蛋白基質(zhì)中則無血小板和其它細胞成分。

掃描電鏡下觀察可見PRF標本存在大量纖維蛋白聚集并形成疏松的立體網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。在PRF標本的紅色區(qū)域分布大量紅細胞，在淡黃色區(qū)域為致密成熟的纖維蛋白基質(zhì)，而在這兩個區(qū)域的交界處有大量血小板和白細胞聚集，血小板沿纖維蛋白束聚集，以血小板集合物呈現(xiàn)。而在接種ADSCs并培養(yǎng)一周后的PRF中，可見大量ADSCs細胞粘附在PRF的纖維蛋白網(wǎng)絡中。

2.3 創(chuàng)面愈合情況：傷后3d，PRF-ADSCs組、PRF組和正常對照組創(chuàng)面均有新鮮肉芽組織生長，創(chuàng)面面積均有明顯縮小，創(chuàng)面肉芽組織呈鮮紅色、柔軟、易出血，糖尿病對照組創(chuàng)面肉芽組織略顯蒼白，表面有少量壞死組織及黃色分泌物覆蓋。傷后7d，4組創(chuàng)面進一步縮小，均無明顯壞死組織覆蓋及感染發(fā)生，PRF-ADSCs組、PRF組和正常對照組創(chuàng)面面積縮小較糖尿病對照組創(chuàng)面更加顯著。傷后14d，PRF-ADSCs組、PRF組和正常對照組創(chuàng)面基本完全愈合，糖尿病對照組創(chuàng)面面積已有顯著縮小，但仍有部分創(chuàng)面未愈合。

傷后3、7、10、14d 4個時間點的創(chuàng)面愈合率行球形檢驗結(jié)果顯示P<0.001，說明各組不同時間點的愈合率之間是存在相關(guān)性的;采用重復測量設計的方差分析，結(jié)果顯示4組間創(chuàng)面愈合率比較，差異具有統(tǒng)計學意義（F=112.4，P<0.001）;LSD法進行兩兩比較，結(jié)果顯示PRF-ADSCs組愈合率優(yōu)于其它3組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;糖尿病對照組愈合率差于其它3組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.001）;PRF組和正常對照組愈合率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.057）。

4組創(chuàng)面愈合時間行方差齊性檢驗（P=0.446），采用單因素方差分析顯示4組間創(chuàng)面愈合時間比較，差異具有統(tǒng)計學意義（F=108.1，P<0.001）;LSD法進行兩兩比較，結(jié)果顯示PRF-ADSCs組和正常對照組的愈合時間優(yōu)于其它2組（P<0.01），PRF組的愈合時間優(yōu)于糖尿病對照組（P<0.001）。見表1。

2.4 創(chuàng)面組織病理學觀察：傷后14d可見PRF-ADSCs組、PRF組和正常對照組創(chuàng)面組織表皮覆蓋完全，真皮結(jié)構(gòu)致密，皮膚結(jié)構(gòu)基本恢復正常，有大量毛細血管存在，毛細血管計數(shù)分別為18.6±2.9、18.0±2.0、18.5±1.8;糖尿病對照組創(chuàng)面組織炎性浸潤明顯，表皮層較薄，真皮結(jié)構(gòu)相對疏松，毛細血管計數(shù)為10.0±1.0，少于其它3組且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

2.5 創(chuàng)面組織CD31表達情況：CD31主要表達于創(chuàng)面組織中的血管內(nèi)皮細胞的細胞漿，呈棕黃色顆粒狀，傷后14d，PRF-ADSCs組及正常對照組CD31陽性細胞計數(shù)分別為49.3±2.5、45.5±1.8，顯著高于PRF組40.3±3.8，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;而糖尿病對照組19.0±2.0，少于其它3組且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。提示PRF治療后可增加創(chuàng)面血管數(shù)量，促進創(chuàng)面血管新生。

3? 討論

據(jù)統(tǒng)計目前全球共有糖尿病患者約3.82億，約占成年人口數(shù)的8.3%。如果發(fā)生DFU，將有近20%發(fā)生創(chuàng)面感染的患者最終將面臨不同程度的截肢[10]。不僅使患者的生活質(zhì)量急劇下降，還增加了經(jīng)濟負擔。目前針對DFU患者局部創(chuàng)面的傳統(tǒng)治療方法往往難以達到理想的效果。究其原因，這些方法均主要依賴于局部組織的自我修復能力，而糖尿病患者的組織再生能力較差，很難完全依靠自身的修復能力進行創(chuàng)面的修復。

2001年法國學者Choukroun等開發(fā)出血小板濃縮制劑PRF。PRF具有制備方法簡便、成本低廉以及使用便捷等優(yōu)點，可以釋放許多種類的生長因子[11]，這些因子通過促進細胞分裂增殖，增加膠原合成，促進組織血管化，誘導細胞分化以及清除壞死組織從而加快創(chuàng)面修復和組織再生[12-13]。但是應用PRF后的治療效果依賴于患者自身血小板活性，因此如果患者存在血液系統(tǒng)疾病，行PRF治療的療效可能有限。

近年來，隨著組織工程學和再生醫(yī)學的發(fā)展，干細胞的研究逐漸深入，也為創(chuàng)面修復治療提供了一個新的途徑。ADSCs可通過旁分泌作用表達多種細胞因子。通過這些細胞因子，ADSCs可以起到促進成纖維細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞增殖的作用[14]。筆者研究發(fā)現(xiàn)應用PRF聯(lián)合ADSCs治療糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面，可以顯著促進創(chuàng)面的愈合，相較于單純使用PRF可明顯縮短創(chuàng)面愈合時間。應用PRF聯(lián)合ADSCs治療后14d大部分糖尿病小鼠的創(chuàng)面組織皮膚結(jié)構(gòu)已基本恢復正常，且皮膚毛細血管數(shù)顯著增多。使用PRF聯(lián)合ADSCs治療糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面，可使其愈合過程接近于正常小鼠皮膚創(chuàng)面的愈合過程。

筆者認為PRF聯(lián)合ADSCs能夠有效治療糖尿病創(chuàng)面的可能機制包括：①上調(diào)局部生長因子水平，促進血管再生。有研究表明，經(jīng)血小板濃縮制劑治療后的慢性創(chuàng)面內(nèi)PDGF、TGF-β、VEGF、EGF、IGF-1、HGF等生長因子濃度均有不同程度升高[15]。同時，ADSCs也同樣可以分泌多種生長因子[16]。這些生長因子的表達上調(diào)，可促進血管再生，改善局部血供[17]，促進纖維母細胞、上皮細胞的分裂、增殖和分化，促進細胞外基質(zhì)合成和膠原生成，這些對于肉芽組織基質(zhì)形成、創(chuàng)面再上皮化及瘢痕組織的形成將產(chǎn)生重要的作用[18];②提供纖維蛋白支架。PRF作用于局部糖尿病創(chuàng)面后，血小板、白細胞和ADSCs均被支架內(nèi)基質(zhì)蛋白粘附，從而漸進地釋放各種生長因子，呈遞給靶細胞，這不僅可防止生長因子等活性物質(zhì)在創(chuàng)面大量流失，還可延長PRF在局部的效應時間，使組織擁有相對持久的生長因子來源[19];③釋放抗菌活性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，血小板濃縮制劑對葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌以及念珠菌和新隱球菌等皮膚潰瘍的常見病原菌具有抗菌作用[20]，這主要與血小板活化后α顆粒內(nèi)釋放的抗菌肽等密切相關(guān)[21]。此外，血小板活化后還可釋放趨化因子、免疫球蛋白、組胺和腺苷等抗菌活性物質(zhì)，這些物質(zhì)可能通過a.誘導血小板聚集，直接抑制或殺滅病原體;b.趨化和激活白細胞間接發(fā)揮抗微生物效應，從這兩個方面發(fā)揮抗微生物作用[20]。

總之，PRF和ADSCs可以在創(chuàng)面愈合的各個階段發(fā)揮作用，可以作為創(chuàng)面修復的一條新的途徑。但是，其對于糖尿病創(chuàng)面治療的療效和安全性仍需要更多的研究加以證實。此外，現(xiàn)有的研究也并不足以完全闡明PRF和ADSCs對于創(chuàng)面修復的作用機制。因此，仍需要進行更深入的探索及研究。希望最終可以將PRF聯(lián)合ADSCs修復創(chuàng)面的方法應用于臨床，為創(chuàng)面不愈的患者提供一種安全、有效、經(jīng)濟、便捷的治療手段。

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